The DEAD-Box RNA Helicase DDX3 Interacts with NF-κB Subunit p65 and Suppresses p65-Mediated Transcription

doi:10.1371/journal.pone.0164471

.2016年10月13日；11（10）：e0164471。

doi:10.1371/journal.pone.0164471。电子收集2016。

DEAD-Box RNA螺旋酶DDX3与NF-κB亚基p65相互作用并抑制p65介导的转录

年香¹, 苗河¹, 穆萨拉特·伊沙克¹, 于高¹, 宋飞飞², 梁国¹, 李玛¹, 孙桂红², 刘丹², 郭德银^1 2, 于晨¹

附属公司

PMID： 27736973
预防性维修识别码：项目编号：5063347
内政部： 10.1371/日记.pone.0164471

DEAD-Box RNA螺旋酶DDX3与NF-κB亚基p65相互作用并抑制p65介导的转录

年香等。公共科学图书馆一号. 2016.

.2016年10月13日；11（10）：e0164471。

doi:10.1371/journal.pone.0164471。电子收集2016。

作者

年香¹, 苗河¹, 穆萨拉特·伊沙克¹, 于高¹, 宋菲菲², 梁国¹, 李玛¹, 孙桂红², 刘丹（Dan Liu）², 郭德银^1 2, 于晨¹

附属公司

¹武汉大学生命科学学院病毒学国家重点实验室，武汉，中国。
²武汉大学基础医学院，中国武汉。

PMID： 27736973
预防性维修识别码：项目编号：5063347
内政部： 10.1371/日记.pone.0164471

摘要

RNA解旋酶家族成员具有多种细胞功能，包括转录、前mRNA加工、RNA衰变、核糖体生物生成、RNA输出和翻译。RNA解旋酶DEAD-box家族成员DDX3被认为是肿瘤相关因子和转录共激活物/调节器。在这里，我们证明DDX3与核因子（NF）-κB亚单位p65相互作用并抑制NF-κB（p65/p50）介导的转录活性。RNA干扰下调DDX3诱导NF-κB（p65/p50）介导的转录上调。NF-κB（p65/p50）介导的转录活性的调节通过其下游细胞因子如IL-6和IL-8的表达水平进一步证实。此外，DDX3依赖ATP的RNA解旋酶结构域与p65的N末端Rel同源结构域（RHD）的结合参与了NF-κB调节基因转录的抑制。总之，结果表明DDX3的功能是抑制NF-κB亚单位p65的转录活性。

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数字

**图1。DDX3抑制TNFα-、IKKβ-、c-Rel、NIK-和p65诱导的NF-κB转录活性。**
DDX3抑制TNFα、IKKβ、c-Rel-、NIK-和p65诱导的NF-κB激活。293T细胞与报告质粒（50 ng）共转染，*雷尼利亚*荧光素酶控制质粒pRL-TK（20 ng）和pHA-DDX3（400 ng或指示量）或空载体pcDNA3.0（400 ng）作为阴性对照。转染后20小时，萤火虫和*雷尼利亚*测定荧光素酶活性。（A至E）5xNF-κB荧光素酶报告子（5xNFκB-luc）被TNFα（20 ng/ml）或100 ng IKKβ、c-Rel、NIK或p65激活。（F至J）E-selectin荧光素酶报告子（E-selectin-luc）被TNFα（20 ng/ml）或100 ng IKKβ、c-Rel、NIK或p65激活。用对应于每个诱导因子的100 ng空载体转染模拟（非诱导）对照。数据绘制为平均值±标准偏差(n个=3，平均值±SD）。**p＜0.01、***p＜0.001和***p＜0.0001（非配对学生t检验）。（K）所有指示基因的表达通过使用指示抗体的Western blotting进行确认。

**图2。shRNA沉默内源性DDX3导致NF-κB介导的转录活性上调。**
（A） DDX3特异性shRNA质粒抑制293T细胞内源性DDX3蛋白表达。空白载体用作阴性对照。DDX3通过抗DDX3抗血清检测（上面板）。β-肌动蛋白被用作内部对照，表明装载了等量的总蛋白（下面板）。（B至D）内源性DDX3敲除上调p65、TNFα或IKKβ诱导的NF-κB转录活性(n个=3，平均值±SD）。**p<0.01和***p<0.001（未配对学生t检验）。用对应于每个诱导因子的100 ng空载体转染模拟（非诱导）对照。

**图3。siRNA沉默内源性DDX3可增加NF-kB介导的转录活性。**
（A）两种不同DDX3特异性siRNA对293T细胞内源性DDX3蛋白表达的抑制。一个不相关的siRNA（siNC）被用作阴性对照。使用抗DDX3抗体检测DDX3，β-肌动蛋白作为内部对照（上面板）。与β-肌动蛋白相比，内源性DDX3的相对表达水平在下面板中进行了量化。（B至D）内源性DDX3的敲除上调TNFα、IKKβ或p65诱导的NF-κB介导的转录激活（n=3，平均值±SD）。*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001（未配对学生t检验）。用对应于每个诱导因子的100 ng空载体转染模拟（非诱导）对照。

**图4。DDX3与NF-κB p65亚单位的相互作用。**
（A） DDX3在哺乳动物双杂交系统中与p65特异性相互作用。这里，用Gal4-luc报告质粒（100 ng）和等量的pVP-DDX3和pM-p65（350 ng）或各种对照质粒共同转染293T细胞。转染48小时后测定荧光素酶活性(n个=3，平均值±SD）。***p<0.001和****p<0.0001（未配对学生t检验）。（B）标记DDX3和HA标记p65的免疫沉淀。293T细胞与Flag-DDX3、HA-p65或空载体联合转染。用抗HA抗体免疫沉淀HA标记的蛋白，并用Flag抗体免疫印迹，以检测是否存在Flag标记的DDX3（co-IP）（上层）。HA抗体用于检测IP部分（中间层）。使用抗-HA或抗Flag抗体分别检测细胞裂解液（输入，下层）中的HA-p65或Flag-DDX3。（C）内源性DDX3和p65的免疫沉淀。用DDX3多克隆抗体或IgG免疫沉淀来自未转染293T细胞的裂解液。用小鼠单克隆p65抗体进行Western blotting检测到内源性p65（co-IP）（上层）的存在。DDX3多克隆抗体用于检测IP部分（中间层）。下图显示了裂解液中类似数量的DDX3和p65。（D） GST下拉分析。纯化的GST-DDX3或GST蛋白与His-p65孵育，并用谷胱甘肽树脂珠拉下。用所示抗体通过Western blotting检测每个样本。GST蛋白作为阴性对照。（E）在未转染的293T细胞上进行间接免疫荧光，以使用特异性抗p65和抗DDX3抗体确定p65和DDX3的内源性共定位。给出了DDX3、p65和DAPI核染色（蓝色）的合并图像（黄色）。

**图5。p65的Rel同源结构域与DDX3特异性结合，DDX3的ATP依赖性RNA解旋酶活性对其抑制NF-κB靶基因表达具有重要作用。**
（A） HA标记p65 wt和缺失突变体的共免疫沉淀。用转染Flag-DDX3（4μg）和HA-p65 wt或缺失突变体（1–332或299–551）（4μg）的293T细胞的裂解液进行免疫沉淀分析。使用抗-HA抗体捕获免疫复合物。用小鼠单克隆抗体免疫印迹法检测免疫沉淀物中的DDX3。使用抗Flag和抗HA抗体分别检测全细胞裂解液（中层和下层）中的Flag-DDX3和HA-p65 wt以及缺失突变体（1-332或299-551）。（B）通过Western blotting检测截短的DDX3（1–310）和DDX3的表达水平。（C至F）截短的DDX3对NF-κB介导的基因表达的影响。5xNF-κB-luc报告基因被TNFα（20 ng/ml）或100 ng IKKβ、NIK或p65激活。用400 ng DDX3、DDX3（1–310）、DDX3（310–662）或空载体（pcDNA3.0，阴性对照）共同转染细胞。萤火虫和*雷尼利亚*测定荧光素酶活性(n个=3，平均值±SD）。（G）通过蛋白质印迹法检测DDX3-K230E的表达水平。（H至K）依赖ATP的DDX3 RNA解旋酶突变体对NF-κB介导的基因表达的影响。5xNF-κB-luc报告基因被TNFα（20 ng/ml）或100 ng IKKβ、NIK或p65激活。用400 ng野生型或突变型DDX3表达质粒（HA-DDX3-K230E）或空载体（pcDNA3.0，阴性对照）共同转染细胞。萤火虫和*雷尼利亚*测定荧光素酶活性(n个=3，平均值±SD）。**p<0.01、***p<0.001和****p<0.0001（未配对学生t检验）。用对应于每个诱导因子的100 ng空载体转染模拟（非诱导）对照。

**图6。DDX3（HA-DDX3-T275R/E277V）的双重突变使NF-κB靶基因表达的抑制作用失效。**
（A至D）5xNF-κB-luc报告基因被TNFα（20ng/ml）或100ng的IKKβ、NIK或p65激活。用400 ng野生型或突变型DDX3表达质粒（HA-DDX3-T275R/E277V）或空载体（pcDNA3.0，阴性对照）共同转染293T细胞。萤火虫和*雷尼利亚*测定荧光素酶活性(n个=3，平均值±SD）。***p<0.001和****p<0.0001（未配对学生t检验）。用对应于每个诱导因子的100 ng空载体转染模拟（非诱导）对照。

**图7。DDX3在细胞质中结合p65。**
（A）转染载体（2μg）或DDX3表达质粒（2μc）的293T细胞的免疫印迹分析。转染24小时后用TNFα（20 ng/ml）处理所示细胞。转染后30小时获得细胞核和细胞质提取物。LMNB1和β-微管蛋白分别用作核和细胞质对照。（B和C）对每个组分中p65的水平进行量化，并将其归一化为LMNB1或β-微管蛋白的水平。

**图8。DDX3的过度表达或敲除调节IL-6和IL-8的表达水平。**
HepG2细胞转染对照载体（1μg）、DDX3表达质粒（1μg）、阴性对照siRNA（siNC）（50 nm）或siRNA-DDX3-2（50纳米），如图所示。（A和B）转染后24小时，用TNFα（20 ng/ml）刺激指示细胞6小时。分别用实时PCR和ELISA检测IL-6和IL-8的mRNA（A）和蛋白（B）水平。GAPDH mRNA水平作为内部控制。联合转染NIK表达质粒（0.2μg）刺激（C和D）HepG2细胞。转染后24小时，分别用实时PCR和ELISA检测IL-6和IL-8的mRNA（C）和蛋白（D）水平。n个=3，平均值±标准偏差。*p<0.05，**p<0.01，**p<0.001和***p<0.0001（非配对学生t检验）。

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