Promotion of RAD51-Mediated Homologous DNA Pairing by the RAD51AP1-UAF1 Complex

doi:10.1016/j.celrep.2016.05.007

.2016年6月7日；15(10):2118-2126.

doi:10.1016/j.celrep.2016.05.007。 Epub 2016年5月26日。

RAD51AP1-UAF1复合物促进RAD51介导的同源DNA配对

附属公司

¹耶鲁大学医学院分子生物物理和生物化学系，美国康涅狄格州纽黑文06520。
²耶鲁大学医学院儿科血液肿瘤科，纽黑文，CT 06520，美国；耶鲁大学医学院病理学系，美国康涅狄格州纽黑文06520。
^三科罗拉多州立大学环境与放射健康科学系，科罗拉多州柯林斯堡，CO 80523，美国。
⁴耶鲁大学医学院儿科血液肿瘤科，纽黑文，CT 06520，美国；耶鲁大学医学院病理学系，美国康涅狄格州纽黑文06520，电子地址：gary.kupfer@yale.edu。
⁵耶鲁大学医学院分子生物物理和生物化学系，美国康涅狄格州纽黑文06520，电子地址：patrick.sung@yale.edu。

PMID： 27239033
预防性维修识别码：项目编号5381662
内政部： 2016年10月10日/j.celrep.2016.05.007

RAD51AP1-UAF1复合物促进RAD51介导的同源DNA配对

梁凤山等。单元格代表. 2016.

.2016年6月7日；15(10):2118-2126.

doi:10.1016/j.celrep.2016.05.007。 Epub 2016年5月26日。

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¹耶鲁大学医学院分子生物物理和生物化学系，美国康涅狄格州纽黑文06520。
²耶鲁大学医学院儿科血液肿瘤科，纽黑文，CT 06520，美国；耶鲁大学医学院病理学系，美国康涅狄格州纽黑文06520。
^三科罗拉多州立大学环境与放射健康科学系，科罗拉多州柯林斯堡，CO 80523，美国。
⁴耶鲁大学医学院儿科血液肿瘤科，纽黑文，CT 06520，美国；耶鲁大学医学院病理学系，美国康涅狄格州纽黑文06520，电子地址：gary.kupfer@yale.edu。
⁵耶鲁大学医学院分子生物物理和生物化学系，美国康涅狄格州纽黑文06520，电子地址：patrick.sung@yale.edu。

PMID： 27239033
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摘要

UAF1-USP1复合物在范科尼贫血DNA损伤反应通路的执行过程中会激活FANCD2。因此，UAF1缺失导致持续的FANCD2泛素化和DNA损伤超敏反应。UAF1缺陷细胞也会因同源重组而受损DNA修复。在此，我们证明UAF1结合DNA并与RAD51AP1形成二聚体复合物，RAD51重组酶的辅助因子，以及通过RAD51AP1与RAD51形成三聚体复合物。UAF1中的两个小的泛素样修饰体（SUMO）样结构域和RAD51AP1中的一个SUMO相互作用基序介导复合物的形成。重要的是，UAF1增强RAD51介导的同源DNA配对，其方式依赖于与RAD51AP1的复合物形成，但与USP1无关。从机械上讲，RAD51AP1-UAF1与RAD51合作组装突触复合体，这是同源重组中的关键核蛋白中间产物，细胞研究揭示了RAD51AP1-UAF1蛋白复合体的生物学意义。我们的发现为UAF1在基因组维护中的明显USP1独立作用提供了见解。

PubMed免责声明

数字

**图1。通过这些蛋白质中的SIM和SLD1-SLD2结构域形成RAD51AP1-UAF1复合物**
（A）用GST标记的RAD51AP1孵育链霉菌Ⅱ标记的UAF1、UAF1-436X、MBP标记的UAF1-SLD1、UAF1-SLD2和UAF1-SDL1/SLD2（SLD1/2），并在谷胱甘肽树脂上捕获蛋白质复合物并用SDS-PAGE分析。S、含有未结合蛋白的上清液；W、洗涤；E、谷胱甘肽树脂的十二烷基硫酸钠洗脱液。（B）图中显示了UAF1-SLD1与SUMO2的对齐情况。星号突出显示了UAF1和SUMO2中的K459和K33残基。箭头和螺旋分别表示β片和α螺旋。（C） GST标记的RAD51AP1与Strep II标记的UAF1（WT）或指示的UAF1突变体孵育，并用谷胱甘肽树脂捕获蛋白质复合物。分析与（A）相同。（D）序列分析显示RAD51AP1中氨基酸残基137-142之间存在SIM。星号突出显示了用于诱变的残留物。Hs、，智人; 嗯，*小家鼠*; Bt、，*Bos金牛*; 雷诺数，*褐家鼠*; 点，*黑猩猩*将GST标记的RAD51AP1（WT）或指示的RAD512AP1突变体与Strep II标记的UAF1孵育，并用谷胱甘肽树脂捕获蛋白质复合物。分析如上。（F）突出显示RAD51AP1-UAF1交互域的示意图。另请参见图S1。

**图2。通过RAD51AP1和UAF1中的DNA-结合活性将UAF1与RAD51关联**
（A）链球菌II标记的UAF1（WT）或UAF1-EEA与RAD51AP1、RAD51AP1-LI2A和RAD51单独或联合培养。在Strep-Tactin树脂上捕获蛋白质复合物，并对不同组分进行分析，如图1A所示。MBP标记的UAF1 SLD1-SLD2（SLD1/2）同样与RAD51AP1和RAD51孵育，并使用多糖树脂捕获三聚体蛋白复合物。对照实验证实RAD51AP1-RAD51不与多糖树脂发生非特异性结合（数据未显示）。（B）链球菌II标记的UAF1与RAD51AP1、酵母Rad51或其组合孵育，如（A）所示进行链球菌Tactin下拉。（C）用放射性标记的80-merss DNA孵育链霉菌II标记的UAF1-FL或UAF1-436X。分析了DNA的迁移率变化。用SDS和蛋白酶K（SDS+PK）处理可从核蛋白复合物中释放DNA。对数据进行量化并绘制图表。误差条表示三个独立实验数据的平均值±S.D。（D） UAF1和UAF1-436X结合放射性标记dsDNA的能力分析如（C）所示。另请参见图S2。

**图3。RAD51AP1和UAF1在RAD51介导的D-loop形成中的协同作用**
（A） D环测定示意图。（B）对RAD51、RAD51AP1、Strep II标记的UAF1以及这些蛋白的指示组合进行了形成D环的能力测试。三个独立实验的D-loop产物百分比显示为平均值±S.D.（C）。UAF1的K459E和EEA突变体在D-loop反应中用RAD51AP1测试。数据分析如（B）所示。（D） RAD51AP1的IV2A和LI2A突变体在D-loop反应中用UAF1进行测试。另请参见图S3。

**图4。RAD51-RAD51AP1-UAF1的双链DNA捕获和突触复合体组装**
（A）双重捕获分析示意图。（B）将RAD51AP1、Strep II标记的UAF1或这些蛋白质的组合与RAD51突触前丝一起孵育，并分析捕获dsDNA的能力。显示捕获的dsDNA的百分比。误差条表示三个独立实验数据的平均值±S.D。（C）突触复合体组装示意图*Ssp公司*我消化。（D） RAD51AP1、Strep II标记的UAF1或其组合与RAD51突触前丝一起孵育，并保护dsDNA免受*Ssp公司*我进行了消化分析。1号车道是没有*Ssp公司*我在治疗。对受保护的DNA进行量化和绘图。误差线是三个独立实验的平均值±S.D。另请参见图S4。

**图5。RAD51AP1-UAF1复合物在DNA损伤修复和HR中的作用**
（A）表达FLAG标记UAF1野生型（WT）或突变型（K459E或EEA）的HeLa细胞的提取物与抗FLAG M2琼脂糖树脂共同进行免疫沉淀分析。蛋白质通过蛋白质印迹法显示。（B）通过Western blotting测定具有组成性shRNA-介导的UAF1敲除并稳定表达野生型或指示突变型UAF1的HeLa细胞中的蛋白质水平。不含shUAF1的细胞作为对照。采用Ku86作为加载控制。（C）用MMC、CPT或olaparib处理（B）中所述的HeLa细胞，并在37°C孵育5天后测定细胞数量，并将其归一化为未处理对照。存活细胞的百分比显示为三个独立实验的平均值±S.D。（D）用HA-tagged I基因转染U2OS-DR-GFP细胞，该细胞具有组成性shUAF1介导的UAF1敲除，并稳定表达野生型或突变型UAF1-*Sce公司*I质粒，用于GFP的流式细胞术分析。蛋白质水平显示在左侧面板中。修复效率以GFP阳性细胞的百分比进行评分。C、不带I的控制单元-*Sce公司*我；1、shRNA控制细胞；2、shUAF1细胞；3、具有UAF1的shUAF1细胞；4、shUAF1细胞与UAF1-EEA；5，shUAF1细胞与UAF1-K459E。误差条表示S.E.M.**表示P<0.01，未配对t检验。（E） UAF1在FA通路和HR中作用的模型。UAF1作为FA通路中心DUB酶的底物靶向亚单位，也是RAD51-RAD51AP1的重要辅因子，以促进HR期间突触复合体的组装。另见图S5。

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