使用条形码融合遗传学筛选混合基质蛋白相互作用
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PMID： 27107012 -
预防性维修识别码： 项目经理488762 -
内政部： 10.15252/msb.20156660
使用条形码融合遗传学进行基质-蛋白质相互作用筛选
摘要
数字
每个细胞携带两个工程基因座，这样每个基因座都可以通过位于特定位点重组位点两侧的条形码进行识别。 在Cre重组酶存在下，双交叉DNA重组被诱导形成嵌合“融合”条形码，代表基因座的组合。 可以在一个池中测试多种成对的试剂组合。 融合的条形码可以通过深度测序进行扩增和分析，以分析每个X‐Y组合对应的细胞丰度。
条形码诱饵和猎物目的质粒的设计。 每个目的质粒携带两个DNA条形码（BC1和BC2），与 液氧磷 和 液氧2272 网站。 带有条形码的诱饵或猎物目的地载体 loxP’ ‐BC1‐ 液氧2272 ‐连接器‐BC2或BC1‐连接器 loxP’ ‐BC2‐ 液氧2272 酵母内组装基BFG‐Y2H的PspOMI限制位点的片段（红色箭头），以及 全体 基于重组克隆的BFG‐Y2H（蓝色箭头），以便在成对末端序列读取中识别条形码–ORF组合( loxP’ 表示的反向补语 液氧磷 ). BC1和BC2的每个区域都由一个独特的25 bp DNA条形码组成，条形码两侧有共同的正向和反向启动位点，允许PCR扩增条形码：诱饵BC1的O059和O060位点； 诱饵‐BC2的O061和O062位置； 猎物的O063和O064位置‐BC1； 猎物-BC2的O065和O066 PCR启动位点。 BFG‐Y2H工具箱菌株RY1010（MAT 一 )和RY1030（材料 α )Cre重组酶只能在两个工具箱菌株交配获得的二倍体中诱导表达。 A类 P（P） CMV公司 ‐rtTA‐堪萨斯州MX4 （工具包‐ 一 盒式磁带）碎片替换了 加拿大1 Y8800染色体和a的区域 吨 ADH1（ADH1） ‐P公司 二氧化二乙酯 ‐创建-T CYC1（日历年1） ‐坎MX4 （工具包 α 磁带）更换 加拿大1 Y8930地区。 基于Tet-On系统的Cre表达式的图示。 在强力霉素（doxycycline，dox）存在下，rtTA蛋白被激活，通过 四氧化二铁 2 发起人。 对PCR进行基因分型以确认工具箱菌株。 通过对菌株RY1010、RY1030、Y8800和Y8930的直接PCR，成功创建了工具箱菌株。 对于每个菌株，野生型的5′和3′区域的存在 加拿大1 分别用O067和O068引物（TKgt1-PCR）以及O069和O070引物（TKgt2-PCR）进行检测。 工具包的集成 一 磁带位于 加拿大1 通过TKgt3（扩增 CAN1 5′/P型 CMV公司 O067和O071引物的边界），TKgt4（ 实时技术援助 通过O072和O073引物编码区域）和TKgtMX4 PCR（ MX4/CAN1 3′ O074和O070引物的边界）。 最后，工具包的集成 α 磁带由TKgt5检查（ CAN1 5英尺/T ADH1（ADH1） O067和O075引物的边界），TKgt6（ Cre公司 通过O076和O077引物编码区域）和TKgtMX4 PCR。 所有引物序列见表EV5。
A类 诱饵-BC1和猎物-BC2在诱饵和猎物质粒之间物理交换的主要和最短重组途径。 B 通过CHX处理不同二倍体菌株以对抗选择的CYH2编码质粒，证明诱饵质粒上的条形码交换（有关TKgt1和TKgt3基因分型PCR的详细信息，请参见图EV1）。 CHX治疗导致质粒丢失的证据用“*”表示。 “RY”代表我们的工具箱应变背景，“Y”代表最新Y2H实验中常用的Y应变背景（附录注释S1）。 C类 不同菌株背景下融合和未融合条形码的基因分型PCR（TKgt1/2/3/5 PCR的描述见图EV1）。 与融合条形码对应的PCR产品用“*”表示。 D类 从两个二倍体菌株的混合物中获得的BC1‐BC1和BC2‐BC2融合条形码的频率，使得每个二倍体毒株具有唯一的条形码诱饵和猎物质粒。 E、 F类 小规模BFG‐Y2H的演示。（E）从CCSB人类PRS和RRS版本1（hsPRSRRSv1）中选择了14个正参考集（PRS）对（海军细胞）和7个随机参考集（RRS）对。 通过配对测试，14对PRS在X‐Y和Y‐X配置中均呈Y2H阳性。 （F） BFG‐Y2H筛选具有–His+3-AT、–Ade和无选择控制（+His+Ade）条件的小规模矩阵。
文库规模的酵母内组装，以产生携带条形码ORF表达质粒的Y2H菌株。 在每个反应中，Gal4 DNA结合或激活域、ORF、条形码和主干DNA片段被直接组装 体内 在工具箱中 一 或工具包‐ α 应变背景。 通过酵母内组装获得的条形码Y2H菌株。 菌落生长表明酵母细胞含有正确组装的质粒。 黄色方框表示“无ORF片段”阴性对照。 基于酵母组装的条形码菌株生成的质量确认。 在酵母内组装后，分离单个菌落，并通过酵母菌落PCR回收DNA片段。 “TK”表示基因分型PCR，以确认确定工具包菌株的染色体基因座的存在。
两个含有随机25 bp序列区域的寡核苷酸DNA池与位点特异性重组位点结合( 液氧磷 和 液氧2272 )通过PCR，通过Gibson组装与线性质粒主干片段组装。 生成的随机条形码质粒池被转换为 大肠杆菌 细胞。 单个随机条形码 大肠杆菌 采集菌落并将其分离到384孔板中，通过行-柱板（RCP）-PCR（附录注释S2）鉴定每个孔中的一对独特条形码。 RCP‐PCR旨在通过一次下一代测序运行，确定微孔板中排列的许多菌株的条形码序列的身份、平板和微孔位置。 在384孔格式反应中，16个带有行特定DNA索引标签的正向引物和24个带有列特定DNA索引标记的反向引物被分布到相应的行和列位置。 正向和反向行/列特异性引物的末端也有板状引物降落点。 对单个板执行RC‐PCR，将行和列标签缝合到每个条形码。 然后用平板收集RC‐PCR产物。 Plate‐PCR将Plate索引标签和Illumina配对末端测序适配器缝合到每个RC‐PCR产品池中。 将平板PCR产物合并并测序 全体 识别每行-列板坐标处条码区域的序列。
A类 标准化融合条码丰度显示为1）非选择性条件，基于测序深度处观察到的融合条码丰量，该深度仅足以准确确定条码边缘丰度（“+低饱和度下观察到的His”）； 2） 非选择性条件，根据单个条码频率的边际丰度推断（“+His推断”），以及3）基于观察到的融合条码丰度的选择性条件（“-His”和“3-AT”）。 B、 C类 每个ORF对的标准化融合条形码计数平均值( （f） 平均的 )（B）非选择性（+His）条件和（C）选择性（-His）条件。 CS：校准设置空间在屏幕上出现峰值。 D类 的相关性 （f） 平均的 在选择性条件下不同复制类型对之间（散点图为对数标度）。 E类 条码融合效率分析。 位于上下游的7‐bp侧翼基序组合的频率 液氧磷 （黄色箭头）或 液氧2272 通过Illumina Nextera测序分析（绿色箭头）位点的–His情况。 F类 根据马修斯相关系数（MCC）优化参数的CENT屏幕的交互分数曲线，以重现先前报告的Y2H交互。
A、 B类 在有（A）和无（B）七个自动激活器的非选择性（+His）、选择性（–His）和严格选择性（3-AT）条件下，融合条形码计数的分布。 C类 非选择性条件下（+His，具有自激活剂）的归一化行总丰度和列总丰度的分布，分别推断出交配前诱饵和猎物单倍体菌株丰度的分布。 D、 E类 CENT屏幕上的信息在没有七个自动激活器的情况下执行。 （D） 在非选择性条件下观察到的归一化融合条形码丰度分布（+低饱和度下观测到的His），使用选择性条件（−His和3-at）中观测到的行和列总丰度（+His推断）推断非选择性条件。 （E） 每个ORF对的标准化融合条形码计数平均值( （f） 平均的 )在非选择性（+His）和选择性（−His）条件下。 CS：校准设置空间在屏幕上出现峰值。 F类 BFG‐Y2H相互作用分数与GPCA荧光素酶强度之间的相关性。 背景MCC热图显示了在每个阈值组合下两个数据集的重叠。
实验流程示意图。 在CENT筛选期间提取酵母质粒DNA后，在单独的实验程序中，通过φ29基于聚合酶的滚动圈扩增（RCA）扩增+His和–His条件下的质粒DNA样本。 然后通过PCR从RCA处理的DNA池中扩增融合的条形码并测序（Illumina MiSeq）。 同时，对整个质粒DNA池进行测序（Illumina Nextera文库制剂在Illumiana MiSeq上测序）。 使用适当的参考数据库映射的Nextera测序读取计数。 在全质粒测序读取中发现人类ORF。 ORF根据读取密度排序，定义为读取计数除以ORF长度（读取/bp）。 黄色条表示屏幕中询问的中心体ORF； 黑色条表示“意外”ORF。 +His条件的测序结果涵盖了所有中心体ORF，而在–His Y2H筛选条件（缺失）中未发现一些中心体ERF，因为并非所有ORF都编码相互作用蛋白。 通过Nextera测序发现的ORF中的读取密度，评估中心体ORF与非中心体ERF分离的精密召回曲线。 ORF读取密度和相应条形码拷贝数之间的相关性。 根据heptamer估计条码融合效率 液氧 –Nextera测序中发现的七肽组合读取+His条件（图4E中可以找到−His条件数据）。 黄色和绿色箭头表示 液氧磷 和 液氧2272 站点。
BFG‐Y2H评分的前100个蛋白质对，以及它们在高质量文献策划的蛋白质相互作用集（Lit‐BM‐13）、最近系统化的高质量人类相互作用组数据集（HI‐II‐14）或策划的BioGRID蛋白质相互作用数据集中的存在（见材料和方法）。 “联合”代表Lit‐BM‐13、HI‐II‐14和BioGRID中相互作用蛋白对的联合。 恢复以前报告的交互的性能（“Union”）。 GPCA对BFG‐Y2H‐阳性（+）与BFG-Y2H−阴性（−）点击数的回收率，以及对重复测试阳性（+。 阳性对照组中蛋白质对的GPCA荧光素酶强度（四倍体）分布（定义为GPCA测试空间与HI‐II‐14和Lit‐BM‐13数据集的结合的重叠，Rolland 等 ，2014年； 表EV2），秩1–55，56–100，两两Y2H重测阳性，两两Y2H管道中的自动激活剂和BFG‐Y2H阴性对* P（P） < 0.05, ** P（P） < 10 −5 、和*** P（P） < 10 −15 （Mann‐Whitney U‐测试）。 BFG‐Y2H捕捉到HAUS1命中率。 针对不同的相互作用得分阈值，在蛋白质界面处对残余接触物进行折叠富集。 折叠变化计算为两组蛋白质对的平均残基接触次数与每个相互作用得分阈值的比值。 P（P） 使用Mann–Whitney计算值 单位 ‐测试。
的示意图 全体 重组克隆过程。 随机条形码诱饵或猎物目的质粒池与进入ORF质粒池相结合，并进行Gateway-LR反应。 通过细菌转化和菌落筛选分离出随机条形码ORF表达克隆，并通过测序进行鉴定。 BFG‐Y2H就绪诱饵和猎物单倍体池的产生 全体 将纯化的条形码诱饵和猎物表达质粒池转化为合适的交配型酵母细胞。 分配给至少 n个 横轴上显示的条形码。 ORF的磨损及其在台阶处的长度 全体 基于重组克隆的BFG‐Y2H程序** P（P） < 10 −4 和*** P（P） < 10 −7 .
A类 测试的四个蛋白质对空间（CENT、CCC、CV和CVA）大小增加的示意图。 B 每个BFG‐Y2H屏幕识别的蛋白质相互作用网络。 红线表示新的相互作用，蓝线表示BFG‐Y2H捕捉到的先前已知的相互作用（“联合”集合中的那些），灰线表示BFG-Y2H未捕捉到的命中列表中蛋白质之间的已知相互作用。 C类 通常在所有四个屏幕中测试的18个校准对的子矩阵。 X和Y ORF被命令在对角线上呈现校准对。 D类 CV和CVA交互之间的重叠。 E、 F类 使用Lit‐BM‐13测量每个BFG‐Y2H筛网的性能，并在将两个筛网空间限制为其通用ORF后将其与HI‐II‐14进行比较。 G公司 病毒体蛋白（V‐V）和COSMIC癌蛋白（C‐C）之间的蛋白质相互作用数量以及相同病毒蛋白靶向的病毒体相互作用数量。 灰色条表示通过随机边缘重新布线随机生成的网络的期望值。
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