Metabolic Regulation of Gene Expression by Histone Lysine β-Hydroxybutyrylation

doi:10.1016/j.molcel.2016.03.036

.2016年4月21日；62(2):194-206.

doi:10.1016/j.molcel.2016.03.036。

组蛋白赖氨酸β-羟基丁酸化对基因表达的代谢调控

谢忠余¹, Di Zhang先生¹, 钟东军², 沾云汤^三, 何晃¹, 伦智戴¹, 山康奇¹, 李靖雅⁴, 戈兹德·科拉克¹, 岳晨¹, 夏春梅⁴, 赵鹏¹, 海滨阮⁵, 马特·柯基⁶, 王丹丽（Danli Wang）¹, 林迪·M·詹森⁷, Oh Kwang Kwon先生⁸, 桑圭·李⁸, 斯科特·德普莱彻⁷, 民家滩⁴, 大卫·B·伦巴第⁹, 凯文·怀特⁶, 赵红玉¹⁰, 贾丽⁴, 罗伯特·G·罗德^三, 杨晓勇¹¹, 赵英明¹²

附属机构

¹Ben May美国伊利诺伊州芝加哥大学癌症研究系60637。
²耶鲁大学公共卫生学院生物统计学系，美国康涅狄格州纽黑文06520；美国南卡罗来纳医科大学公共卫生科学系，南卡罗莱纳州查尔斯顿，邮编29425。
^三美国纽约州洛克菲勒大学生物化学与分子生物学实验室，邮编：10065。
⁴中国科学院上海药物研究所药物研究国家重点实验室，上海201203。
⁵美国康涅狄格州纽黑文市耶鲁大学医学院比较医学科和细胞与分子生理学系，邮编06520。
⁶美国伊利诺伊州芝加哥市芝加哥大学基因组学和系统生物学研究所，邮编：60637。
⁷密歇根大学分子与综合生理学与老年医学中心系，美国密歇根州安阿伯48109。
⁸KK21 Plus KNU基于多组学的创新药物研究团队，韩国大邱41566，Kyungpook国立大学药学院和药物科学研究所。
⁹密歇根大学病理学系和老年学研究所，美国密歇根州安娜堡48109。
¹⁰耶鲁大学公共卫生学院生物统计学系，美国康涅狄格州纽黑文06520；美国康涅狄格州纽黑文耶鲁大学计算生物学和生物信息学项目，邮编：06511；耶鲁大学医学院遗传学系，美国康涅狄格州纽黑文06520。
¹¹美国康涅狄格州纽黑文市耶鲁大学医学院比较医学和细胞与分子生理学系，邮编06520。电子地址：xiaoyong.yang@yale.edu。
¹²美国伊利诺伊州芝加哥市芝加哥大学本·梅癌症研究系，邮编：60637。电子地址：yingming.zhao@uchicago.edu。

PMID： 27105115
预防性维修识别码：项目编号C5540445
内政部： 2016年10月10日/j.molcel.2016.03.036

组蛋白赖氨酸β-羟基丁酸对基因表达的代谢调节

谢忠余等。分子电池. 2016.

.2016年4月21日；62(2):194-206.

doi:10.1016/j.molcel.2016.03.036。

作者

附属机构

¹Ben May美国伊利诺伊州芝加哥大学癌症研究系60637。
²耶鲁大学公共卫生学院生物统计学系，美国康涅狄格州纽黑文06520；美国南卡罗来纳医科大学公共卫生科学系，南卡罗莱纳州查尔斯顿，邮编29425。
^三美国纽约州洛克菲勒大学生物化学与分子生物学实验室，邮编：10065。
⁴中国科学院上海药物研究所药物研究国家重点实验室，上海201203。
⁵美国康涅狄格州纽黑文市耶鲁大学医学院比较医学科和细胞与分子生理学系，邮编06520。
⁶美国伊利诺伊州芝加哥市芝加哥大学基因组学和系统生物学研究所，邮编：60637。
⁷密歇根大学分子与综合生理学与老年医学中心系，美国密歇根州安阿伯48109。
⁸KK21 Plus KNU基于多组学的创新药物研究团队，韩国大邱41566，Kyungpook国立大学药学院和药物科学研究所。
⁹密歇根大学病理学系和老年学研究所，美国密歇根州安娜堡48109。
¹⁰耶鲁大学公共卫生学院生物统计学系，美国康涅狄格州纽黑文06520；美国康涅狄格州纽黑文耶鲁大学计算生物学和生物信息学项目，邮编：06511；耶鲁大学医学院遗传学系，美国康涅狄格州纽黑文06520。
¹¹美国康涅狄格州纽黑文市耶鲁大学医学院比较医学和细胞与分子生理学系，邮编06520。电子地址：xiaoyong.yang@yale.edu。
¹²美国伊利诺伊州芝加哥市芝加哥大学本·梅癌症研究系，邮编：60637。电子地址：yingming.zhao@uchicago.edu。

PMID： 27105115
预防性维修识别码：项目编号C5540445
内政部： 2016年10月10日/j.molcel.2016.03.036

摘要

在这里，我们报道了一种β-羟基丁酸衍生的蛋白质修饰，赖氨酸β-羟基丁酸（Kbhb），作为一种新型组蛋白标记的鉴定和验证。在长期禁食或链脲佐菌素诱导的糖尿病酮症酸中毒小鼠的培养细胞和肝脏中，组蛋白Kbhb标记显著受到β-羟丁酸水平升高的影响。我们总共鉴定了44个组蛋白Kbhb位点，这一数字与组蛋白乙酰化位点的已知数量相当。通过ChIP-seq和RNA-seq分析，我们证明组蛋白Kbhb是富含活性基因启动子的标记，饥饿期间H3K9bhb水平升高与饥饿反应代谢途径中基因上调有关。因此，组蛋白β-羟基丁酸化代表了一种新的表观遗传调控标记，它将代谢与基因表达结合起来，为研究染色质调控和β-羟基丁酸盐在人类重要病理生理状态（包括糖尿病、癫痫和瘤变）中的多种功能提供了新的途径。

PubMed免责声明

数字

**图1。赖氨酸β-羟基丁酸化的鉴定与验证**
（A）八种可能的异构体的化学结构，其可导致源自HEK293核心组蛋白的胰蛋白酶肽（B）和合成肽（C）的+86.0368Da的质量位移（B，C）MS/MS光谱。K（K）_交流电表示乙酰赖氨酸和K_必和必拓表示β-羟基丁基赖氨酸。插图显示了双电荷前体肽离子的质量电荷比（m/z）。x轴和y轴分别表示m/z和相对离子强度。（D）通过HPLC/MS/MS分析重建离子色谱图体内-衍生肽及其合成K_必和必拓对应物及其混合物，显示两种肽的共洗脱。x轴和y轴分别表示HPLC/MS分析和MS信号的保留时间。另请参见图S1。

**图2。用同位素β-羟基丁酸盐标记组蛋白Kbhb标记**
（A） β-羟基丁酸和β-羟基丁酰-CoA的生物合成途径。还描述了三个酮体：β-羟基丁酸、乙酰乙酸和丙酮。（B）从（R/S）-β-羟基丁酸酯-[2,4鉴定的胰蛋白酶肽的MS/MS光谱-¹³C类₂]-处理过的HEK293细胞。星号表示同位素标记引起的质量变化。（C）质谱法检测经指示浓度的同位素Rβ-羟基丁酸钠处理的HEK293细胞中的同位素β-羟基丁酰-CoA(¹³C类₄). 数据表示为三个独立实验的平均值（±SEM）。（D）斑点法和竞争法检测pan抗Kbhb抗体的特异性。使用pan抗Kbhb抗体进行斑点试验，并显示修饰肽库的数量。文库由CXXXXKXXXX肽的混合物组成，其中C是半胱氨酸，X是除半胱氨酸外的所有19种氨基酸的混合物，第6个残基是赖氨酸：R-或S-β-羟基丁酰基赖氨酸（Kbhb）（左面板）；R-β-羟基丁酰基赖氨酸、2-羟基异丁基赖氨酸（K2hib）、2-羟基丁酰基赖氨酸。竞争是通过将泛抗Kbhb抗体与10倍过量的未修饰肽或含Kbkb的肽孵育而进行的（右图）。另请参见图S2。

**图3。组蛋白β-羟基丁酸化受细胞β-羟基丁酸水平的代谢调节**
（A）组蛋白的免疫印迹分析*酿酒酵母S.cerevisiae，黑腹果蝇D.melanogaster*使用泛抗Kbhb抗体的S2细胞、MEF细胞和HEK293细胞。（B）剂量增加的β-羟基丁酸钠处理HEK293细胞组蛋白的免疫印迹分析。（C）用葡萄糖酮计测量“喂食”或“禁食”小鼠的血糖和β-羟丁酸浓度。数据表示为平均值（±SEM）。使用了20只“喂食”和30只“禁食”小鼠**P＜0.01，***P＜0.001。（D）使用所示抗体通过Western blot检测“喂食”或“禁食”小鼠肝脏中的组蛋白Kbhb和Kac水平。（E） “健康”或“STZ治疗”小鼠的血糖和β-羟丁酸浓度。数据表示为平均值（±SEM）。使用六对健康和链脲佐菌素（STZ）处理的小鼠**P<0.01，***P<0.001。（F）使用所示抗体通过Western blot检测“健康”或“STZ治疗”小鼠肝脏中的组蛋白Kbhb和Kac水平。另请参见图S3。

**图4。人和小鼠细胞组蛋白Kbhb位点的蛋白质组学筛选**
改性赖氨酸残基以红色突出显示。有关相应的MS/MS光谱，请参见数据S1-S3。

**图5。组蛋白Kbhb标记的全基因组定位**
（A）组蛋白Kbhb在肝细胞中的全基因组分布。条形图显示组蛋白H3K4me3、H3K9ac、H3K9bhb、H4K4bhb和H4K8bhb，以及启动子（蓝色）、内含子（红色）、外显子（紫色）和基因间区域（绿色）上类似大小（基因组）的峰的随机分布。启动子定义为已知转录起始位点（TSS）周围±2kb的区域。（B） H3K9bhb信号（对数₂ChIP/输入）。活性TSS被定义为与前20%表达量最高的基因相对应的TSS。同样，非活性TSS被定义为对应20%最低表达基因的TSS。（C）使用活性组蛋白标记或抑制标记对H3K9bhb富集进行皮尔逊相关系数估计，使用对数计算₁₀-启动子区域（H3K9bhb、H3K9 ac和H3K4 me3）或基因体（H3K 27me3和H3K 9me3）中转化的ChIP读取计数。*（p<0.05）、**（p<0.01）、***（p<0.001）和***（p<0.05）。（D） H3K9bhb信号强度（标度对数₂ChIP/input）在启动子区域中具有最高25%、第二25%、第三25%和最低25%的RNA-seq计数。（E）组蛋白H3K9bhb、H3K9 ac、H3 K4 me3和RNA Pol II（Ser5p）分布的ChIP-qPCR分析*Hnf4a型*基因。数据表示为三个独立实验的平均值（±SEM）。NS（p>0.05）、*（p<0.05）、**（p<0.01）和***（p<0.001）。另请参见图S4。

**图6。饥饿诱导的H3K9bhb增加与活性基因表达相关**
（A）热图显示启动子区域周围H3K9bhb-、H3K9-ac-和H3K4me3-ChIP-seq信号的变化（TSS周围±4kb）。在所有三张热图中，基因的顺序是相同的，这三张热图是基于饥饿（ST）条件下H3K4me3标记的ChIP-seq读取计数。每个热图中的黑色垂直线表示TSS的位置，信号的变化以对数表示。（B）饥饿时H3K9bhb和H3K4me3的ChIP-seq信号变化之间的相关性。对于每次修改，ChIP-seq数据的库大小在“饥饿”（ST）和“喂养”（AL）条件之间进行了标准化。系数。估计=0.57，p值<0.0001。（C）饥饿时H3K9bhb和H3K8ac的ChIP-seq信号变化之间的相关性。对于每次修改，ChIP-seq数据的库大小在“饥饿”（ST）和“喂养”（AL）条件之间进行了标准化。系数。估计=-0.03，p值=0.5274。（D）使用基因集富集分析（GSEA）对H3K9bhb ChIP-seq数据进行KEGG通路分析。根据标准化富集分数（NES）的顺序，列出了饥饿反应中前10条H3K9bhb富集途径。图S5D中的星号表示相同的路径。另请参阅表S4中的基因列表及其排名。正常喂养或禁食48小时的小鼠肝脏中H3K9bhb-、H3K4me3-和H3K8ac-ChIP产物的（E-G）qPCR分析。数据表示为平均值±SEM（n=3）。NS（p>0.05）、*（p<0.05）、**（p<0.01）和***（p<0.001）。（H）皮尔逊相关系数估计值表示诱导基因表达和感兴趣组蛋白标记增加之间的相关性。使用t分布计算P值。（一）禁食48小时期间基因表达的RT-qPCR分析。相对表达标准化为*肌动蛋白*数据表示为各组三只小鼠相对表达（禁食与喂食）的平均折叠变化±标准偏差。数据表示为平均值±SEM（n=3）。（J）饥饿期间组蛋白修饰增加标记的上调基因的维恩图。根据饥饿期间H3K9bhb、H3K8ac和H3K4me3修饰的ChIP-seq信号的折叠变化，选择前700个基因。维恩图显示了饥饿后基因表达增加的前700个基因的数量。（K）饥饿诱导基因与组蛋白标记增加有关。所有1742个上调基因（log₂-用表达≥0.5的转换折叠变化来生成这个文氏图。每个圆圈中的数字代表启动子区域中H3K9bhb、H3K9-ac或H3K4me3的ChIP-seq信号分别增加至少2倍的上调基因。另请参见图S5-S7。

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