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.2016年2月25日；164(5):911-21.
doi:10.1016/j.cell.2016.01.019。 Epub 2016年2月11日。

微管蛋白谷氨酰胺化切断微管的分级控制

马克斯·瓦伦斯坦 1, 安东妮娜月饼 2
附属公司

微管蛋白谷氨酰胺化切断微管的分级控制

马克斯·瓦伦斯坦等。 单元格. .

摘要

微管切断酶对于轴突、纺锤体和纤毛中复杂微管阵列的生物发生和维持至关重要，其中微管蛋白去甲酰化、乙酰化和谷氨酰化非常丰富。这些修饰表现出刻板的模式，表明微管功能的空间和时间控制。利用人工设计和差异修饰的微管，我们发现谷氨酰化是遗传性痉挛性截瘫微管切断酶痉挛素的主要调节因子。谷氨酰胺化起着变阻器的作用，并根据每个微管蛋白中添加的谷氨酸数量来调节微管的切断。出乎意料的是，谷氨酰化是一种非线性双相调谐器，超过阈值后会变得抑制。此外，局部谷氨酰化的抑制作用在邻近微管中传播，调节反式谷氨酰的切断。我们的工作为微管蛋白翻译后修饰的分级反应和微管蛋白谷氨酰化与微管阵列复杂结构（如痉挛素缺乏引起疾病的神经元）之间的生化联系提供了第一个定量证据。

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作者声明没有竞争性的经济利益。

数字

图1。
图1.微管蛋白谷氨酰化对痉挛催化微管切断的分级调节。
（A–E）。左侧，痉挛催化微管切断未修饰微管（A）和谷氨酰胺化水平增加的微管（B–E）。比例尺，2μm。左图所示的分离分析中使用的微管的右反相LC-MS（实验程序）。这些制剂中有一种可检测的α（α1β）和两种β（βI和βIVb）亚型。总之，添加到α和β-微管蛋白亚型中的谷氨酸盐数量分别以灰色和绿色表示。谷胱甘肽数量的加权平均值(E类>)添加到α-和β-微管蛋白中（两种β亚型的总体和单独）表示为α+<nE类>和，β+<nE类>（实验程序）。另请参见图S1。
图2。
图2：空腹蛋白催化的微管切断显示了对微管蛋白谷氨酰化水平的双相反应。
（A） 空腹蛋白催化的微管切断随微管蛋白尾部谷氨酸盐的数量而变化。E类>α和β-微管蛋白，分别以灰色和绿色表示。误差棒，S.E.M.（来自多个腔室的n>23个微管）。分离率标准化为未经修饰的微管的分离率（实验程序）。（B-C）调节β-微管蛋白谷氨酰化水平足以增加（B）或减少（C）微管切断活性，而α-微管蛋白质谷氨酰化水平保持不变（质谱见图S2A和S2B）。误差棒，S.E.M.（n=来自B和C的多个腔室的23个微管）。****p<0.0001；***p<0.001。顶板，切断反应的进度曲线；底板，切断率如（A）所示。（D） 微管切断活性对β-微管蛋白谷氨酰化水平高度敏感（质谱见图S2C）。误差棒，S.E.M.（n=来自多个腔室的23个微管）†p>0.01顶面板，切断反应的进度曲线；底板，切断率如（A）所示。（E） 当α-微管蛋白谷氨酰化保持不变时，β-微管蛋白质谷氨酰化度的增加足以在微管切断中诱导双相反应（质谱，见图S2D）。误差棒，S.E.M.（n=来自多个腔室的24个微管）。****p<0.0001；**p＜0.01。顶板，切断反应的进度曲线；底板，切断率如（A）所示。
图3。
图3：痉挛素介导的微管切断需要β-，而不是α-微管蛋白C末端尾部。
（A） 缺失α-或β-尾部的人重组微管的左、标准化微管切断率（左轴）和结合亲和力（右轴）（图S3A）。误差棒，S.E.M.（n>34或70微管，分别来自多个室，用于分离和结合分析）。没错，被痉挛素切断的人造人体微管。箭头表示分离的站点。比例尺，2μm。另请参见图S3。（B） 人重组酪氨酸化和去酪氨酸化微管的左、标准化微管切断率（左轴）和结合亲和力（右轴）。误差棒，S.E.M.（n>15微管用于分离分析；n>96微管用于结合分析，来自多个腔室）。对应于α-微管蛋白峰的酪氨酸化（灰色）和去酪氨酸化的（黄色）微管的右侧重叠反相LC-MS。
图4。
图4α-微管蛋白乙酰化不影响痉挛素介导的微管切断。
（A） 左侧，未经修饰和乙酰化的人体微管的正常痉挛切断活动。误差棒，S.E.M.（来自多个室的未修饰和乙酰化微管分别为50和27）。未修饰（灰色）和乙酰化（品红色）α-微管蛋白的右侧重叠反相LC-MS显示与乙酰化物种对应的42 Da质量位移。β-微管蛋白（未显示）中未检测到质量变化。
图5。
图5.亲和性和特异性活性之间的竞争导致了微管蛋白谷氨酰化对spastin催化的微管切断的双相调节。
（A） Spastin对微管的亲和力随着微管尾部谷氨酸盐的数量增加而增加。修饰微管上的Spastin结合归一化为未修饰微管）<n个E类>α和β-微管蛋白的表达如图1所示。误差棒，S.E.M.（n=来自多个腔室的50根微管E类>)。（B） Spastin微管亲和力随微管蛋白上谷氨酸的数量线性增加（R2= 0.99). 左侧，微管切断率，k光突发事件，右，微管结合常数，K一对于各种<nE类>归一化为未经修饰的微管。误差线表示S.E.M.（C）微管切断率，作为具有不同谷氨酰化水平的微管的痉挛素浓度的函数。增加的谷氨酰化导致微管切断的反操作性更早、更突然地开始。误差棒，S.E.M.（n>21个微管来自多个腔室E类>)。灰色阴影，从合作行为过渡到反合作行为的区域。（D） 在每个微管蛋白固定数量的结合痉挛素分子下，不同谷氨酰化水平的微管切断活性。结合型痉挛素的比活性随着谷氨酰化的增加而降低。误差棒，S.E.M.（n>20个微管，每个微管来自多个腔室<n个E类>)。（E） 谷胱甘肽诱导的微管亲和力增加和酶特异性活性降低之间的竞争产生了痉挛素对微管谷胱甘苷化水平的双相反应。另请参见图S4。
图6。
图6游离聚谷氨酸抑制痉挛素微管切断
（A） 0.75–3 kDa聚谷氨酸（6至23个谷氨酸盐）存在时微管切断率。误差棒，S.E.M.（n>24个来自多个腔室的微管）（B）存在3–15 kDa聚谷氨酸（23至115个谷氨酸盐）时的微管切断率。误差棒，S.E.M.（来自多个腔室的n>24个微管）。另请参见图S5。
图7。
图7.Spastin催化的切断活性由相邻微管的谷氨酰化水平调节。
（A） Spastin与未经修饰和谷氨酰化的微管（顶部，面板E类>~6.8 E，底板，<nE类>约22.3 E）。洋红，未经修饰的微管；黄色，谷氨酰化微管（<nE类>第6.8条或第22.3条）；绿色，DyLight 488标记为痉挛素。比例尺，2μm。（B） 在具有混合微管群的腔室中，Spastin具有切断活性。分离或存在具有规定谷氨酰化水平的等摩尔浓度微管时未修饰微管的分离活性(E类>第6.8、10.9、18.5或22.3节）。误差棒，S.E.M.（n>17个来自多个腔室的微管）。
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中的注释

  • 抓住微管。
    Schaletzky J，Rape M。 Schaletzky J等人。 细胞。2016年2月25日；164(5):836-7. doi:10.1016/j.cell.2016.02.016。 细胞。2016 PMID：26919420

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