A novel Fanconi anaemia subtype associated with a dominant-negative mutation in RAD51

doi:10.1038/ncomms9829

案例报告

.2015年12月18:6:8829。

doi:10.1038/ncomms9829。

与RAD51显性阴性突变相关的新型范科尼贫血亚型

附属公司

¹荷兰阿姆斯特丹1081 BT Van der Boechoststraat 7，VU大学医学中心临床遗传学系。
²卢森堡系统生物医学中心，生物医学院，7 Avenue des Hauts-Fourneaux，Esc/Alzette L-4362，Luxembourg。
^三系统生物学研究所，美国华盛顿州西雅图特里大道北401号，邮编：98109-5234。
⁴荷兰癌症研究所生物应激反应部，地址：荷兰阿姆斯特丹1066 CX，Plesmanlaan 121。
⁵荷兰加利福尼亚州鹿特丹3000号，邮政信箱2040，癌症基因组中心遗传学部。
⁶荷兰加利福尼亚州鹿特丹3000号伊拉斯谟医疗中心放射肿瘤学部，邮政信箱2040。
⁷劳伦斯·伯克利国家实验室，美国加利福尼亚州伯克利市回旋加速器路1号，邮编94720。
⁸德国杜塞尔多夫40225 Moorenstrasse 5号海因里希·海因大学医学院儿童和青少年健康中心儿科肿瘤、血液学和临床免疫学系。
⁹Deutsche Fanconi-Anämie-Hilfe e.V.，德国乌纳市Böckenweg 4号，邮编：59427。
¹⁰荷兰癌症研究所质谱和蛋白质组学设施，地址：荷兰阿姆斯特丹1066 CX，Plesmanlaan 121。
¹¹太平洋西北糖尿病研究所，720 Broadway，Seattle，Washington 98122，USA。
¹²荷兰莱顿2333ZA，Albinusdreef 2，莱顿大学医学中心人类和临床遗传学系。

PMID： 26681308
预防性维修识别码：第703882页
内政部： 10.1038/ncomms9829

案例报告

与RAD51显性阴性突变相关的新型范科尼贫血亚型

纳吉姆·阿梅齐安等。国家公社. 2015.

.2015年12月18:6:8829。

doi:10.1038/ncomms9829。

作者

附属公司

¹荷兰阿姆斯特丹1081 BT Van der Boechoststraat 7，VU大学医学中心临床遗传学系。
²卢森堡系统生物医学中心，生物医学院，7 Avenue des Hauts-Fourneaux，Esc/Alzette L-4362，Luxembourg。
^三系统生物学研究所，美国华盛顿州西雅图特里大道北401号，邮编：98109-5234。
⁴荷兰癌症研究所生物应激反应部，地址：荷兰阿姆斯特丹1066 CX，Plesmanlaan 121。
⁵荷兰加利福尼亚州鹿特丹3000号，邮政信箱2040，癌症基因组中心遗传学部。
⁶荷兰加利福尼亚州鹿特丹3000号伊拉斯谟医疗中心放射肿瘤学部，邮政信箱2040。
⁷劳伦斯·伯克利国家实验室，美国加利福尼亚州伯克利市回旋加速器路1号，邮编94720。
⁸德国杜塞尔多夫40225 Moorenstrasse 5号海因里希·海因大学医学院儿童和青少年健康中心儿科肿瘤、血液学和临床免疫学系。
⁹Deutsche Fanconi-Anämie-Hilfe e.V.，德国乌纳市Böckenweg 4号，邮编：59427。
¹⁰荷兰癌症研究所质谱和蛋白质组学设施，地址：荷兰阿姆斯特丹1066 CX，Plesmanlaan 121。
¹¹太平洋西北糖尿病研究所，720 Broadway，Seattle，Washington 98122，USA。
¹²荷兰莱顿2333ZA，Albinusdreef 2，莱顿大学医学中心人类和临床遗传学系。

PMID： 26681308
预防性维修识别码：第703882页
内政部： 10.1038/ncomms9829

摘要

范科尼贫血（Fanconi anaemia，FA）是一种遗传性疾病，对DNA交联诱导的染色体不稳定具有超敏反应，与发育异常、骨髓衰竭和癌症的强烈易感性有关。据报道，共有17个FA疾病基因，均以隐性遗传方式作用。这里我们报告了一个新的g.41022153G>a；FA样患者同源重组DNA修复基因RAD51的一个等位基因中的p.Ala293Thr（NM_002875）错义突变。这种杂合子突变导致了一种新的FA亚型“FA-R”，这似乎是由显性负突变引起的FA的第一个亚型。该患者以小头畸形和精神发育迟滞为特征，成年后没有出现典型的骨髓衰竭和儿科癌症。结合最近关于RAD51相关先天性镜像运动障碍的报道，我们的结果指出，除了DNA修复和癌症易感性外，RAD51介导的同源重组在神经发育中也发挥着重要作用。

PubMed免责声明

数字

**图1。先证者细胞的FA-特征性细胞表型。**
(一)添加150和300后染色体断裂的细胞（受刺激的初级淋巴细胞）数量 nM MMC，来自先证者（VU697）及其健康妹妹（VU730）；*P（P）*值=0.0001(χ²-测试）。(b条)健康个体（LN9SV）、FANCA缺陷个体（GM6914）和先证者（VU697F_SV40）SV40转化成纤维细胞中自发和MMC诱导的染色体断裂；*P（P）*值=0.005(χ²-测试）。(**c（c）**)健康个体（LN9SV）和先证者未经或经50或100治疗的SV40转化成纤维细胞的细胞周期分布 72毫米MMC 小时(d日——**（f）**)先证者淋巴母细胞经DNA损伤剂治疗后的生长抑制分析。评估淋巴细胞系对MMC、喜树碱和PARP抑制剂KU58948的敏感性。VU697L为先证者淋巴母细胞系，HSC93为野生型对照，VU867L为FANCM缺陷型，VU423L为BRCA2缺陷型，而VU1354L为SLX4缺陷型。误差条表示重复三次实验的标准偏差。

**图2。先证者及其家人的遗传分析。**
(一)基因组分析示意图概述。进行了两种类型的分析。（一）隐性遗传模式（预期为FA，箭头1）和（II）显性遗传模式；*从头开始*突变（箭头2）。NS-I-SS：非同义、独立、拼接变体。(b条)受影响部分的全基因组序列（WGS）数据*RAD51系列*外显子10在综合基因组查看器（IGV）中显示先证者的杂合变异体（以绿色表示的变异），而在所有其他家族成员中观察到纯合野生型序列（左图）。相同区域和个体的桑格测序结果显示在右侧面板中（用箭头指示的变体）。(**c（c）**)先证者淋巴母细胞（VU697L；左）和成纤维细胞（VU 697F_SV40；右）互补DNA的Sanger序列数据显示相同的变体（用箭头表示）。(d日)野生型（HSC93）和先证者（VU697L）淋巴母细胞系和野生型（EVA_SV40，FEN_SV40）及先证者永生化成纤维细胞系的全细胞提取物的Western blot分析。用微管蛋白作为负荷控制测定RAD51水平。

**图3。RAD51突变体的功能评估。**
(一)诱导细胞模型分析。染色体断裂。与诱导野生型RAD51等位基因（LN9SV+WT）的细胞相比，MMC处理后诱导RAD51突变等位基因表达的细胞染色体断裂的细胞数量增加；*P（P）*值=0.001(χ²-测试）。NT，“无治疗”；MMC治疗48 小时，50 纳米MMC。(b条)CellTiter-Blue测试。与表达野生型等位基因的细胞（LN9SV+WT）或用空载体转导的野生型细胞（LN9SV+TET）相比，用MMC处理后，表达突变等位基因（LN9 SV+MUT）的细胞的存活率降低。显示了三个实验的平均值。(**c（c）**)生长抑制试验（细胞计数）。与表达野生型RAD51等位基因的野生型细胞相比，表达突变RAD51等位基因的野型细胞对MMC敏感。误差条表示重复三次实验的标准偏差。(d日)与中的测试相同**c（c）**但含有喜树碱（CPT）。两个生长抑制实验均一式三份。(电子)在MMC治疗前后，多西环素诱导突变体（3-6道）和野生型RAD51（7-10道）的表达。通道1和通道2含有来自未转化LN9SV野生型细胞的提取物。以微管蛋白作为对照测定RAD51的水平。(**（f）**)回复性克隆的分析。桑格序列数据显示突变体缺失*RAD51系列*相邻基因单核苷酸多态性的等位基因和LOHCASC5公司和*DNAJC17公司*（左侧面板）。这个*DCHS2型*第4号染色体上的变异保留在两个回复性克隆中（右侧面板）。

**图4。RAD51的生化研究。**
(一，左面板）RAD51净化。野生型RAD51和RAD51^A293T型纯化后1 μg蛋白质通过含SDS的聚丙烯酰胺凝胶电泳；M、分子量标记。(一，右侧面板）D-loop分析。测试了D-loop形成的效率，报告了联合分子形成和DNA链交换活性；箭头1表示游离寡核苷酸，箭头2表示寡核苷酸与同源超螺旋质粒之间的交换产物。(b条)ATP酶测定。野生型和RAD51的ATP酶活性^A293T型在没有或存在单链DNA的情况下，使用薄层色谱法进行测量。ATP水解的量被绘制为时间的函数。误差条表示三个实验的标准误差。(**c（c）**)EMSA dsDNA。荧光标记双链DNA分子（66 bp）与指示浓度的野生型RAD51或RAD51孵育^A293T型在存在ATP和Ca的情况下²⁺并通过天然琼脂糖凝胶电泳。(d日)定量DNA结合百分比作为蛋白质浓度的函数。误差条表示五到七个实验的标准误差。(电子)EMSA ssDNA。荧光标记单链DNA分子（66 nt）与指示浓度的野生型RAD51或RAD51孵育^A293T型在存在ATP和Ca的情况下²⁺并通过天然聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。(**（f）**)扫描力显微镜（SFM）。野生型人类RAD51在双链DNA上形成的丝状结构的SFM图像 mM KCl（i）和突变RAD51^A293T型（ii）。在30℃条件下双链DNA上形成核蛋白丝的例子 mM KCl通过野生型（iii）和突变型（iv）RAD51。所有图像均为1.5×1.5 μm和高度用0–3范围内的颜色表示 nm，红色到黄色，如比例尺所示。(克)EMSA。EMSA在含有指示浓度的野生型和突变型RAD51的反应混合物中评估了双标记DNA结合。(小时)EMSA检测到的作为RAD51功能的未结合DNA和蛋白质-DNA复合物百分比的量化^A293T型蛋白质浓度。

**图5。RAD51与人类疾病的关系。**
(一)人类、小鼠和酵母RAD51蛋白的ClustalW比对证明了突变aa的保守性（箭头）。此外，还显示了L1和L2对DNA结合很重要，以及Walker A和Walker B区域，它们与核苷酸结合有关；突变就在L2环的旁边。(b条)晶体结构*沃氏甲烷球菌*RADA（MvRadA，古RAD51同源物）已与ATP模拟AMPPNP（PDB 2F1H）和ADP（PDB 3FYH）复合求解，为功能相关的RAD51形式提供了最大的结构洞察力。AMPPNP-一种非水解ATP类似物结合的RAD51二聚体以表面表示形式显示，每个RAD51单体的颜色不同。这表明先证者突变周围的基序（品红色）位于二聚体界面（顶部）。MvRadA中与Ala293等价的残基是甘氨酸（红色），尽管周围的基序高度保守（插入序列比对）。MvRadA核苷酸结合状态的特写视图（右）显示，当与AMPPNP结合时，高亲和力ssDNA-结合状态-包含先证者突变的基序形成一个小的α-螺旋。该螺旋与结合核苷酸和Walker A框（绿色）相互作用。该区域还邻近与ssDNA结合的L2环（L2环末端的球体显示晶体中的无序区域）。相反，当与ADP-低ssDNA-结合状态结合时，先证者的突变基序已从核苷酸和Walker a框转移，并从α-螺旋转变为部分无序环，与AMPPNP状态相比，L2环中出现额外的无序。突变在蛋白质中的位置支持突变影响RAD51蛋白质动力学的观点。(**c（c）**)动画显示RAD51变化对临床表型的不同影响。显性阴性突变可导致FA样疾病，RAD51的单倍体不足（即低水平）可导致神经系统疾病，而肿瘤中异常的RAD51表达水平与治疗反应有关。

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[6] Bogliolo M.等人。编码DNA修复内切酶XPF的ERCC4突变会导致范科尼贫血。Am.J.Hum.遗传学。92, 800–806 (2013).-项目管理咨询公司-公共医学

[7] Sawyer S.L.等人BRCA1的双等位基因突变导致一种新的范科尼贫血亚型。癌症发现。5, 135–142 (2014).-项目管理咨询公司-公共医学

[8] Sawyer S.L.等人BRCA1的双等位基因突变导致一种新的范科尼贫血亚型。癌症发现。5, 135–142 (2014).-项目管理咨询公司-公共医学

[9] Kee Y.&D’Andrea A.D.范科尼贫血的医学分子发病机制和临床治疗科学。科学。《医学》122、3799–3806（2012年）。-项目管理咨询公司-公共医学

[10] Kee Y.&D’Andrea A.D.范科尼贫血的医学分子发病机制和临床治疗科学。科学。《医学》122、3799–3806（2012年）。-项目管理咨询公司-公共医学

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