3C Protease of Enterovirus D68 Inhibits Cellular Defense Mediated by Interferon Regulatory Factor 7

doi:10.1128/JVI.02395-15

.2015年11月25日；90(3):1613-21.

doi:10.1128/JVI.02395-15。打印2016年2月1日。

肠病毒D68 3C蛋白酶抑制干扰素调节因子7介导的细胞防御

梓春香¹, 设计师刘璐², 雷晓波¹, 卓洲¹, 何斌（Bin He）³, 王建伟⁴

附属公司

¹卫生部病原体系统生物学重点实验室和Christophe Mérieux实验室，IPB，CAMS基金会，中国医学科学院病原生物学研究所（IPB），中国协和医科大学，中华人民共和国北京传染病诊治协同创新中心，中华人民共和国杭州。
²卫生部病原体系统生物学重点实验室和Christophe Mérieux实验室，IPB，CAMS基金会，中国医学科学院病原生物学研究所（IPB），中国北京协和医学院。
³美国伊利诺伊州芝加哥伊利诺伊大学医学院微生物与免疫学系tshuo@uic.edu wangjw28@163.com。
⁴卫生部病原体系统生物学重点实验室和Christophe Mérieux实验室，IPB，CAMS基金会，中国医学科学院病原生物学研究所（IPB），中国协和医科大学，中华人民共和国北京传染病诊治协同创新中心，中华人民共和国杭州tshuo@uic.edu wangjw28@163.com。

PMID： 26608321
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肠病毒D68 3C蛋白酶抑制干扰素调节因子7介导的细胞防御

梓春香等。 J维罗尔. 2015.

.2015年11月25日；90(3):1613-21.

doi:10.1128/JVI.02395-15。打印2016年2月1日。

作者

梓春香¹, 设计师刘璐², 雷晓波¹, 卓洲¹, 何斌（Bin He）³, 王建伟⁴

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¹卫生部病原体系统生物学重点实验室和Christophe Mérieux实验室，IPB，CAMS基金会，中国医学科学院病原生物学研究所（IPB），中国协和医科大学，中华人民共和国北京传染病诊治协同创新中心，中华人民共和国杭州。
²卫生部病原体系统生物学重点实验室和Christophe Mérieux实验室，IPB，CAMS基金会，中国医学科学院病原生物学研究所（IPB），中国北京协和医学院。
³美国伊利诺伊州芝加哥伊利诺伊大学医学院微生物与免疫学系tshuo@uic.edu wangjw28@163.com。
⁴卫生部病原体系统生物学重点实验室和Christophe Mérieux实验室，IPB，CAMS基金会，中国医学科学院病原生物学研究所（IPB），中国协和医科大学，中华人民共和国北京传染病诊治协同创新中心，中华人民共和国杭州tshuo@uic.edu wangjw28@163.com。

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摘要

人类肠道病毒68（EV-D68）是小核糖核酸病毒科EV-D属EV-D种的一员。在过去几年中，EV-D68感染在全球范围内发生了集群。美国最近的一起疫情是与严重呼吸道疾病和神经并发症相关的最大疫情。尽管临床症状已被识别，但对该病毒的了解仍然很差。在此，我们报道EV-D68通过下调干扰素调节因子7（IRF7）抑制先天性抗病毒免疫，IRF7是一种在病毒发病中起关键作用的免疫因子。这个过程依赖于3C（pro），一种EV-D68编码的蛋白酶，来介导IRF7的切割。当在宿主细胞中表达时，3C（pro）将Q167和Q189定位在组成激活域内，导致IRF7分裂。因此，野生型IRF7是完全活跃的。然而，IRF7的切割破坏了其激活I型干扰素表达的能力，限制了EV-D68的复制。值得注意的是，IRF7的切割严格要求3C（pro）的蛋白酶活性。总之，这些结果表明3C（pro）和IRF7之间的动态相互作用可能决定EV-D68感染的结果。

重要性：EV-D68是一种全球新出现的病原体，但EV-D68发病机制的分子基础尚不清楚。这里我们报道EV-D68通过靶向免疫因子IRF7抑制先天免疫反应。这涉及EV-D68编码的3C蛋白酶，它介导IRF7的裂解。这些观察结果表明，3C（pro）-IRF7相互作用可能代表指示EV-D68感染的界面。

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数字

图1
EV-68感染的HeLa细胞未激活固有免疫反应。HeLa细胞在MOI为2时感染EV-D68。同时，仙台病毒（Sev）被纳入对照组。在感染后的不同时间点（小时），用SYBR green定量实时PCR评估从细胞中提取的总RNA水平以及IFN-β（A）、IFN-α1（B）、ISG54（C）、ISG 56（D）、RANTES（E）、IP10（F）、IL-8（G）、EV-D68和GAPDH基因的表达。结果表示为mRNA水平相对于0小时收集的细胞中的mRNA水平的增加，并通过使用GAPDH看家基因进行标准化。

图2
EV-D68感染对IRF7的影响。（A） HeLa细胞被模拟感染或感染EV-D68的剂量增加。感染后24小时，用抗IRF7（人类IRF7 C末端附近的靶氨基酸）、IRF3、TBK1、VP1、3C和β-肌动蛋白抗体对细胞裂解物进行Western blot分析。（B） THP1细胞被模拟感染或感染EV-D68的剂量增加。感染后24小时，用IRF7、IRF3、TBK1、VP1和β-actin抗体对细胞裂解物进行Western blot分析。（C）用EV-D68（MOI=1）感染对照组或IRF7敲除的HeLa细胞24小时。用IRF7、VP1和β-actin抗体对细胞裂解物进行Western blot分析。（D）用EV-D68（MOI=2）感染对照组或IRF7敲低的THP1细胞24小时。用IRF7、VP1和β-actin抗体对细胞裂解物进行Western blot分析。（E）从健康献血者分离的外周血单个核细胞被模拟感染或感染的EV-D68剂量增加。感染后24小时，用IRF7、IRF3、TBK1、VP1、3C和β-actin抗体对细胞裂解物进行Western blot分析。（F）用pCMV6-Flag-Myc-IRF7转染293T细胞24小时。然后用增加剂量的EV-D68模拟感染或感染细胞。感染后24小时，使用针对Myc（IRF7的C末端）、VP1、3C和β-肌动蛋白的抗体，通过Western blotting分析细胞裂解物。（G） 293T细胞转染对照质粒或增加数量（50 ng、200 ng和500 ng；楔形）的pCMV6-Flag-Myc-IRF7。转染后24 h，用EV-D68（MOI=2）感染细胞24 h。用Flag（IRF7的C末端）、VP1和β-actin抗体对细胞裂解液进行Western blot分析。（H） 293T细胞按面板G所述进行处理。提取总RNA，并使用SYBR绿通过定量实时PCR评估EV-D68的病毒RNA水平。结果表示为相对于GAPDH RNA水平的病毒RNA水平。*，*P（P）*< 0.05; **,*P（P）*< 0.01. 在面板E和F中，箭头表示EV-D68诱导的解理碎片。

图3
EV-D68的3C蛋白酶裂解IRF7。（A）用编码Myc-Flag-IRF7和GFP或GFP-3C的质粒转染293T细胞。转染后24小时，用抗IRF7（靶向人IRF7的N末端）、Flag、GFP和β-actin抗体对细胞进行裂解和Western blotting分析。（B）用Flag-IRF7和对照质粒或表达GFP-3C的增加量（5ng、10ng、20ng和50ng；楔形）的质粒转染293T细胞。（C和D）转染后24小时，通过Western blotting分析细胞。3C的影响^{赞成的意见}显示EV-D68对IFN-β（C）或IFN-α4（D）启动子激活的影响。将IRF7和GFP-3C以及IFN-β-Luc或IFN-α4-Luc转染293T细胞；pRL-SV40被用作内部控制。转染后24小时，检测细胞裂解物的荧光素酶活性。（E）用Myc-Flag-IRF7和对照质粒或pCDNA3.1-V5-IRES-2A转染293T细胞。转染后24小时，用Flag、V5和β-肌动蛋白特异性抗体对细胞进行裂解和蛋白质印迹分析。（F和G）2A的影响^{赞成的意见}EV-D68对IFN-β（F）或IFN-α4（G）启动子激活的影响。将IRF7和IRES-2A以及IFN-β-Luc或IFN-α4-Luc转染293T细胞；pRL-SV40被用作内部控制。转染后24小时，检测细胞裂解物的荧光素酶活性。***，*P（P）*< 0.001. 在面板A和B中，箭头表示3C^{赞成的意见}-诱导裂解碎片。

图4
（A）蛋白酶抑制剂ruprinvir对IRF7裂解的影响。将Flag-IRF7与GFP或GFP-3C一起转染293T细胞。转染后4小时，细胞与蛋白酶抑制剂rupintrvir（1μM）孵育24小时。然后处理细胞裂解物进行Western blot分析。（B） 3C的相互作用^{赞成的意见}带有IRF7的EV-D68变体。如图所示，用Flag-IRF7和GFP或GFP-3C变体转染293T细胞。用抗Flag抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀（IP）。免疫沉淀和细胞裂解物的等分样品用Flag、GFP和β-actin抗体进行Western blot分析（WB）。（C和D）3C的影响^{赞成的意见}IRF7介导的IFN-β和IFN-α4启动子激活的变体。用编码IRF7和IFN-β-Luc（C）或IFN-α4-Luc（D）的质粒以及GFP或GFP-3C变体转染293细胞。pRL-SV40被包括作为内部对照。转染后24小时，收集细胞以测定荧光素酶活性。***，*P（P）*< 0.001. 在面板A和B中，箭头表示3C^{赞成的意见}-诱导裂解碎片。

图5
3C公司^{赞成的意见}EV-D68在N末端结构域的两个特定位点裂解IRF7。（A）表示3C解理位点和碎片的IRF7示意图^{赞成的意见}EV-D68。（B）野生型IRF7或3C的裂解分析^{赞成的意见}-抗性突变体。如图所示，用丙氨酸或精氨酸取代谷氨酰胺的野生型IRF7或IRF7突变体转染293T细胞，同时转染GFP（1、3、5和7道）或GFP-3C（2、4、6和8道）。转染后24小时，用IRF7、Flag、GFP和β-actin抗体对细胞裂解物进行Western blot分析。（C和D）EV-D68 3C的影响^{赞成的意见}野生型IRF7或3C介导的IFN-β或IFN-α4启动子激活^{赞成的意见}-抗性突变体。用野生型IRF7或IRF7的Q167A/Q189R突变体以及IFN-β-Luc（C）或IFN-α4-Luc（D）转染293T细胞。pRL-SV40用作对照。转染后24小时，检测细胞裂解物的荧光素酶活性。**，*P（P）*< 0.01. （E和F）假定IRF7裂解片段对IFN-β或IFN-α4启动子激活的影响。用IRF7或Myc-Flag-IRF3（全长和由氨基酸1至167和190至503组成的片段）以及IFN-β-Luc（E）或IFN-α4-Luc（F）转染293T细胞。pRL-SV40用作对照。转染后24小时，检测细胞裂解物的荧光素酶活性。（G） 293T细胞按面板G所述进行处理。提取总RNA，并使用SYBR绿通过定量实时PCR评估EV-D68的病毒RNA水平。结果表示为相对于GAPDH RNA水平的病毒RNA水平。（H）用pCMV6载体或IRF7（500 ng）转染293T细胞（全长和由氨基酸1至167和190至503组成的片段）。转染后24小时，用EV-D68（MOI=2）感染细胞24小时。用Myc、VP1和β-actin抗体对细胞裂解液进行Western blot分析。**，*P（P）*< 0.01.

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