NRP1 Regulates CDC42 Activation to Promote Filopodia Formation in Endothelial Tip Cells

doi:10.1016/j.celrep.2015.05.018

.2015年6月16日；11(10):1577-90.

doi:10.1016/j.celrep.2015.05.018。 Epub 2015年6月4日。

NRP1调节CDC42激活促进内皮尖端细胞丝足形成

亚历山德罗·范丁¹, Anastasia Lampropoulou公司¹, 盖亚·盖斯特里², 克劳迪奥·雷蒙迪¹, 瓦伦蒂娜·塞纳托雷¹, 伊恩·扎卡里^三, 克里斯蒂安娜·鲁尔伯格⁴

附属公司

¹伦敦大学学院眼科研究所，伦敦大学学院，11-43 Bath Street，London EC1V 9EL，UK。
²伦敦大学学院细胞与发育生物学系，伦敦大学学院，Gower Street，London WC1E 6BT，UK。
^三伦敦大学学院医学部，伦敦大学街5号，英国伦敦WC1E 6JJ。
⁴伦敦大学学院眼科学院，伦敦大学学院，11-43 Bath Street，London EC1V 9EL，UK。电子地址：c.ruhrberg@ucl.ac.uk。

PMID： 26051942
预防性维修识别码：项目经理4528263
内政部： 2016年10月10日/j.celrep.2015.05.018

NRP1调节CDC42激活促进内皮尖端细胞丝足形成

亚历山德罗·范丁等。单元格代表. 2015.

.2015年6月16日；11(10):1577-90.

doi:10.1016/j.celrep.2015.05.018。 Epub 2015年6月4日。

作者

亚历山德罗·范丁¹, Anastasia Lampropoulou公司¹, 盖亚·盖斯特里², 克劳迪奥·雷蒙迪¹, 瓦伦蒂娜·塞纳托雷¹, 伊恩·扎卡里^三, 克里斯蒂安娜·鲁尔伯格⁴

附属公司

¹伦敦大学学院眼科研究所，伦敦大学学院，11-43 Bath Street，London EC1V 9EL，UK。
²伦敦大学学院细胞与发育生物学系，伦敦大学学院，Gower Street，London WC1E 6BT，UK。
^三伦敦大学学院医学部，伦敦大学街5号，英国伦敦WC1E 6JJ。
⁴伦敦大学学院眼科学院，伦敦大学学院，11-43 Bath Street，London EC1V 9EL，UK。电子地址：c.ruhrberg@ucl.ac.uk。

PMID： 26051942
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中的勘误表

Cell Rep.2015年12月1日；13(9):2037

摘要

新生血管由丝足类扩张的内皮尖端细胞引导，这些内皮尖端细胞对血管生成信号作出反应。镶嵌谱系追踪先前显示NRP1对尖端细胞功能至关重要，尽管其在尖端细胞中的机制作用尚不明确。在这里，我们表明NRP1对于遗传尖端细胞的鉴定是不可或缺的。相反，我们发现NRP1对于形成丝状体爆发至关重要，从形态学上将尖端细胞与相邻的柄细胞区分开来，因为它能够使细胞外基质（ECM）诱导的CDC42活化，CDC42是丝状体形成的关键调节器。因此，NRP1敲除和药物性CDC42抑制同样损害了体外和体内发育中斑马鱼的丝状伪足形成。在小鼠视网膜血管生成过程中，CDC42抑制会损害尖端细胞和血管网络的形成，导致类似于ECM诱导的NRP1信号丢失而非VEGF诱导的NRP2信号丢失的缺陷。我们得出的结论是，NRP1使ECM诱导的丝状伪足形成能够在发芽血管生成过程中发挥尖端细胞功能。

PubMed免责声明

数字

图1
NRP1促进所示基因型E10.5小鼠后脑神经实质内血管侵入和生长（A–C）PECAM免疫组化，心室侧朝上，平板安装；指出了单个菱形体（r）的位置。比例尺，500μm。（A′–C〃）（AC）中装箱区域的放大倍率较高；箭头表示菱形边界中的血管。所示基因型E12.5后脑的（D–I）PECAM免疫组化，平板显示放射状（D–F）或SVP（G–I）血管。清晰的箭头表示脑深部（焦平面以下）径向血管之间的血管簇和箭头血管桥。比例尺，100μm。（J和K）E12.5处桡血管（J）或SVP分支点（K）数量的定量，显示为平均值±SD，n≥8个后脑；星号表示^∗p<0.05和^∗∗∗p<0.001。

图2
NRP1以剂量依赖方式（a–C）调节尖端细胞形态（IB4标记的E11.5指定基因型的同窝后脑）；绿色箭头和箭头分别表示尖端细胞和巨噬细胞。比例尺，50μm。（A′–C′）（AC）中装箱区域的高倍图像。（D）野生型和*编号1*后脑为零，表示为平均值±SD；*编号1*^+/+和*编号1*^+/−n=7个后脑，*编号1*^−/−n=3后脑；星号表示^∗∗∗p<0.001。（E和F）野生型后脑的共焦z叠加，用伊玛瑞斯纤维示踪剂处理，用于丝状体分析。在（E）中，血管丛和丝状伪足分别以蓝色和红色显示。在（F）中，丝状体轨迹显示为白色。（E′和F′）（E）和（F）中方框区域的高倍图像。（G–I）用伊玛瑞斯丝示踪剂定量丝状伪足数量、长度和厚度指数，显示为平均值±SD，n≥3后脑；星号表示^∗p<0.05和^∗∗∗p<0.001。

图3
尖端细胞特异性标记物的表达在*编号1*突变体（A和B）qPCR表达分析*编号1*（A）和*佩卡姆*（B），标准化为*Actb公司*在E11.5所示基因型的后脑中（n=4个）；相对于野生型，突变体的表达水平显示为平均值±SD。指示基因型（各n=4）E11.5后脑中指示尖端细胞标记物和缺口靶基因的（C–H）qPCR表达分析，标准化为*佩卡姆*获得与内皮细胞数量相关的尖端细胞标记物表达的客观测量值；相对于野生型，突变体的表达水平显示为平均值±SD。星号表示纯合或杂合突变体相对于野生型的p值(^∗p<0.05，^∗∗p<0.01，^∗∗∗p<0.001），纯合子相对于杂合子突变体的散列标签p值（p<0.05，p<0.01）。

图4
NRP1是正常CDC42激活所必需的，CDC42或NRP1敲除类似地损害初级人类内皮细胞（A–E）中的肌动蛋白重塑。NRP1使内皮细胞介导的CDC42活化。HDMEC经血清饥饿处理，用载体或ML141处理30分钟（A和E），或转染si-control或si-NRP1和血清饥饿处理（B–E）；非粘附（NA）细胞或粘附细胞在FN上30分钟后的蛋白裂解物与PAK1-GST（A、C和D）或WASP-GST（E，顶部）珠培养，并进行免疫印迹或直接用于免疫印迹（B和E，底部）。在（D）中，用5 ng/ml VEGF165（FN+V）额外刺激HDMEC 15分钟。（F） ML141治疗后CDC42激活受损或ECM刺激的EC中NRP1敲除。活化CDC42被归一化为GST输入，并表示为相对于对照±SD的平均倍数变化；n=3；星号表示^∗p<0.05。（G）内皮细胞内内源性NRP1和CDC42的复杂形成。用对照免疫球蛋白G（IgG）或NRP1抗体免疫沉淀NA和FN粘附HDMEC的裂解物，然后免疫印迹NRP1和CDC42。显示25-kDa IgG带。（H–M）NRP1和CDC42是ECM诱导的ECs肌动蛋白重塑所必需的。在对照组与NRP1 si-RNA转染或载体与ML141转染后，分离HDMEC，将其置于FN上2小时，并用指骨样蛋白染色以标记F-actin和DAPI以显示细胞核。比例尺，20μm。（H、I和K）中方框区域的高倍图像显示在（H′）、（I′）和（K′）中。NRP1敲除（L）或CDC42抑制（M）并在FN上电镀1小时后的微丝定量，显示为每个细胞的平均微样数±SEM；每个条件下n≥42个细胞（星号表示相对于si-NRP1或ML141处理细胞的对照p值：^∗∗p<0.01，^∗∗∗p<0.001；hashtags表示无VEGF-A刺激的FN的p值[FN]相对于有额外VEGF-A-刺激[FN+VEGF]的FN细胞，###p<0.001）。红色箭头表示与FN+VEGF相比，FN上的小孢子减少相似。（N和O）ABL1能够在ECM刺激的EC中激活CDC42。在用si-control或si-ABL1转染后，NA和FN-adherent HDMEC的裂解物用WASP-GST珠培养，然后进行免疫印迹（N，顶部）或直接用于免疫印迹。GST染色和GAPDH免疫印迹证实GST微球和裂解物的输入类似。（O）活化的CDC42标准化为GST输入，并表示为相对于对照±SD的平均倍数变化；n≥3；星号表示^∗p＜0.05。

图5
斑马鱼中的Nrp1敲除或Cdc42抑制会影响血管萌芽（A）*nrp1a/b号*起始密码子（下划线）上游5′UTR的MO核苷酸靶序列*nrp1a基因*和*nrp1b号*; 星号表示相同的核苷酸。（B）抗NRP1抗体识别的肽序列与人和小鼠NRP1以及斑马鱼Nrp1a和Nrp1b的细胞质尾部的比对；星号表示相同的氨基酸残基，结肠表示保守的取代。（C和D）来自对照组和*nrp1a/b号*和*nrp1b号*在使用10%凝胶（C）或4%–12%梯度凝胶（D）电泳后，将MO注射的32-hpf鱼类胚胎用于Nrp1和Akt免疫印迹。（E–L）32 hpf主干共聚焦z堆栈*Tg（fli1a:EGFP）*^第5年斑马鱼和对照组与对照组指示血管参数的相应定量*nrp1a/b号*MO（E–H）和溶媒与ML141治疗（I–L）；比例尺，200μm。在Cdc42抑制后，还可以看到Nrp1击倒导致的尾巴扭结（红色箭头）。方框区域以较高的放大倍数显示在每个相应面板附近，以说明延迟的芽伸长；标尺，25μm。Δ表示芽侵入背躯干受损。所有ISV芽数（F和J）、全长ISV芽（G和K）或横向融合的ISV芽的数量（H和L）显示为平均值±SD（每个处理条件下n≥4条鱼）。星号表示的p值*nrp1a/b号*相对于控件的MO或ML141^∗∗p<0.01，^∗∗∗p<0.001；标签表示75μM的p值相对于25μM ML141#p＜0.05，###p＜0.001。

图6
斑马鱼血管生成过程中Cdc42抑制表型Nrp1敲除（A和B）*nrp1号机组*变体、ML141处理和控制胚胎，通过表面渲染（每个条件的左面板）和纤维追踪来确定芽体积，以确定芽长（每个条件下的右面板中的红线）、丝状体数量以及丝状体长度（白线）。网格刻度，1μm。（C–F）对（A和B）中所示的伊玛瑞斯图像进行定量分析，以确定芽体积和芽长（C和D）、丝足长度和丝足数（E和F）；平均值±SD，n≥8芽*nrp1号机组*相对于对照处理鱼的变体（C和E）和ML141-相对于车用处理鱼（D和F）；星号表示^∗p<0.05，^∗∗p<0.01，^∗∗∗p<0.001，ns>0.05。

图7
CDC42抑制损害视网膜血管的萌芽和分支类似于ABL抑制，但不同于NRP1依赖性VEGF-A信号的丢失（A-C）内皮NRP1丢失或CDC42抑制剂抑制后视网膜血管缺陷的比较。同胞P6视网膜血管的IB4标记*编号1*^{飞行/飞行}缺少老鼠*Cre公司*（n=8）或表示*Pdgfb-iCre-ERT2-Egfp电缆*（n=6）在每日注射三苯氧胺后，从P2到P5（A）或从同窝野生型小鼠每天用载体（n=3）或ML141（n=4）（B）从P2至P5治疗。在（A）中，视网膜联合免疫标记NRP1，以证明突变体中的敲除。（C）血管前部和血管前部后支点丝状突起的量化；平均值±SD；星号表示^∗p<0.05，^∗∗p<0.01，且^∗∗∗p<0.001。（D和E）ABL激酶抑制或VEGF-A与NRP1结合缺失后视网膜血管缺损的比较。IB4标记每天用载体或伊马替尼（D）或*编号1*^Y297A/Y297A缺乏与NRP1和野生型同窝小鼠（E）结合的VEGF-A的小鼠。对于（A）、（B）、（D）和（E。绿色箭头表示正常的血管延伸，红色箭头表示有缺陷的血管延伸以及箭头不规则的长而宽的芽，没有侧向突出或连接。（F） NRP1在血管生成中的作用示意图。NRP1除了在VEGF-a信号传导中作为VEGFR2共受体的经典作用外，还能够激活ABL1和CDC42的ECM依赖性激活。

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