跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2015年5月14日；10（5）：e0123725。
doi:10.1371/journal.pone.0123725。 2015年电子收集。

髓系易位基因-16联合阻遏物促进低氧诱导因子1降解

帕文·库马尔 1, 城市古尔堡 1, 英格·奥尔森 1, 拉姆·阿乔尔 1
附属公司

髓系易位基因-16联合阻遏物促进低氧诱导因子1降解

帕文·库马尔等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

髓系易位基因16（MTG16）联合阻遏物下调多个糖酵解基因的表达，这些基因是低氧诱导因子1（HIF1）异二聚体转录因子的靶点，该转录因子由氧调节不稳定HIF1α和稳定HIF1β亚基组成。因此，我们研究了MTG16是否对抑制糖酵解和刺激线粒体呼吸负向调节HIF1。使用强力霉素Tet-On系统控制B淋巴细胞Raji细胞中MTG16的水平。联合研究结果显示，MTG16与HIF1α相互作用。这种联合需要完整的N末端MTG16残基，包括神经同源区1（NHR1）。此外，电泳迁移率变化分析表明，MTG16与体外PFKFB3、PFKFB4和PDK1启动子中的低氧反应元件（HREs）相关。染色质免疫沉淀分析结果显示HIF1α、HIF1β和MTG16与这些和其他糖酵解基因启动子共表达，与这些蛋白可能参与糖酵化靶基因的调控一致。此外，MTG16与脯氨酰羟化酶D2相互作用，促进HIF1α的泛素化和蛋白酶体降解。我们的发现拓宽了MTG联合阻遏物功能的领域，并揭示了MTG16是控制HIF1α水平的蛋白复合体的一部分。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。MTG16在体外与HIF1a结合。
答：。标记了神经同源区（NHRs）的MTG16蛋白方案。还显示了所研究的截断构造。B类使用GST-HIF1α对表达MTG16的COS-7细胞的全细胞裂解物（WCL）或面板A中显示的MTG16截短结构进行GST下拉分析。为了通过Western blotting（WB）检测下拉的MTG15结构，使用了两种抗体；α-MTG针对MTG8的31–250氨基酸升高，并识别具有完整NHR1的MTG16野生型和截断结构[41]。α-MTG16针对MTG16的452-466氨基酸升高[38]。由GST-HIF1α拉下并由α-MTG（上面板）检测到的MTG16结构用星号标记。由于290–653构造（第5通道）缺少α-MTG抗体的表位，因此未检测到信号。使用与上面板相同的吸墨纸，中间面板显示通过α-MTG16检测到全长MTG16（车道1），但不是MTG16 290-653构造（车道5），表明后一构造没有下拉。作为阳性对照，α-MTG16在WCL（车道6）中检测到MTG16 290-653构造。第三个面板显示了α-MTG检测到的MTG16结构体的全细胞裂解物（WCL）中的输入，并用星形标记。C类为了排除与GST的非特异性结合，使用GST对表达MTG16或所示MTG16截断结构的COS-7细胞的WCL进行下拉分析。未观察到下拉，表明GST缺乏非特定的约束力。GST的WCL输入显示在底部。天使用GST-MTG16对转染HIF1α的COS-7细胞的WCL进行GST下拉分析。显示HIF1α的下拉（上车道）。下部车道显示GST-MTG16的WCL输入。至少三个实验中有一个显示在B到D中。
图2
图2。MTG16和HIF1a共沉淀。
答：。转染COS-7细胞16年中期和HIF1α并按照《材料和方法》中所述，使用α-MTG和α-HIF1α抗体，由IP-Western进行检测。MTG16（沉淀一-MTG）共沉淀HIF1α（顶面板），交互实验表明HIF1α共沉淀MTG16（下面板）。上下面板分别显示了3%全细胞裂解液中HIF1α的输入和MTG16的相应输入。α-β-肌动蛋白的对照实验表明HIF1α或MTG16缺乏非特异性共沉淀（第4车道）。上下面板采用相同的膜进行免疫印迹。B类在Raji-MTG16细胞上进行了与A中相似的实验，用20 ng/ml多西环素（doxycycline，dox）诱导12 h以表达MTG16，并暴露于4%的O2诱导HIF1α。MTG16（用α-MTG沉淀）与HIF1α（顶面板）共沉淀，交互实验表明HIF1α与MTG16共沉淀（下面板）。在3%的全细胞裂解液中，HIF1α或MTG16的输入如通道2所示。作为阴性对照，细胞暴露于20%O2未与多西环素孵育时，未与α-HIF1α或α-MTG发生反应（通道4）。A和B中显示了至少三个实验中的一个。
图3
图3。如电泳迁移率偏移/超偏移分析所示，MTG16与启动子中的HIF1a反应元件结合。
描述了包含HIF1α响应元件（HRE）和PDK1、PFKFB3或PFKFB4启动子侧翼区域的寡核苷酸探针的序列。核提取物来自Raji-MTG16细胞，与20 ng/ml多西环素孵育12 h，以在暴露于4%O的条件下诱导MTG16表达2诱导HIF1α。主要的DNA-核蛋白相互作用用标记位移的箭头表示，而DNA-核蛋白-抗体相互作用则用标记超位移的箭头描述。所有被未标记探针竞争的探针都发生了变化，表明核提取蛋白与含有HRE的生物素化探针有特异性结合。与PDK1、PFKFB3和PFKFB4探针结合的蛋白质被MTG16抗体（α-MTG）“超移位”，但没有与CD63抗体（α-CD63）“超转移”，表明MTG16与探针结合。结果表明，MTG16可能在PDK1、PFKFB3和PFKFB4启动子处与HIF1α结合。显示了三分之一的实验。
图4
图4。染色质免疫沉淀（ChIP）显示，MTG在缺氧条件下与体内HIF1a反应元件结合。
使用从Raji-MTG16细胞中分离的染色质进行ChIP测定4%O 2用20 ng/ml多西环素诱导12 h表达MTG16。显示了包括HRE的PDK1、PFKFB3或PFKFB4的启动子区的示意图。数字与转录起始位点（TSS）有关。指出了实时PCR引物的位置。这些数字表示对应于TSS的启动子中的核苷酸位置。用对照α-β-肌动蛋白、α-MTG（检测MTG16）、α-HIF1α或α-HIFβ抗体免疫沉淀蛋白-DNA复合物，并用qPCR（平均值±SEM，n=3）进行分析。显示了MTG16、HIF1α和HIF1β在HRE上的富集。未发现有对照抗体或无抗体的富集。
图5
图5。染色质免疫沉淀（ChIP）显示，MTG在常压下与体内HIF1a反应元件结合。
ChIP分析如图4所示进行，但染色质是从在20%O 2用20 ng/ml多西环素诱导MTG16表达8或24小时。使用从细胞中提取的染色质对MTG16、HIF1α和HIF1β进行HRE富集，显示在多西林培养8小时时，而在培养24小时时未观察到富集（平均值±SEM，n=3）。未发现有对照抗体或无抗体的富集。显示了三个实验的结果。
图6
图6。染色质免疫沉淀（ChIP）分析与MTG16和HIF1a在LDH、HK和PFK启动子上的体内相互作用一致。
按照材料和方法中的描述，使用从暴露于4%O的Raji-MTG16细胞中分离的染色质进行ChIP分析2用20 ng/ml多西环素诱导产生MTG16 8小时。显示了包括HRE在内的启动子区域的示意图。数字是相对于TSS的。指出了实时PCR引物的位置。用α-MTG（检测MTG16）、α-HIF1α、α-HIF1β或α-β-actin抗体免疫沉淀蛋白-DNA复合物，并用qPCR（平均值±SEM，n=3）进行分析。显示了MTG16、HIF1α和HIF1β在HRE上的富集。在无抗体或α-β-肌动蛋白抗体的情况下未发现富集。
图7
图7。MTG16降低HIF1a水平。
A类通过Western blotting检测暴露于20%O的Raji-MTG16细胞裂解液中HIF1α的水平2用20 ng/ml多西环素诱导MTG16的合成（如α-MTG检测）。孵育8至16小时后，HIF1α检测不到。三个实验中有一个实验的吸液数据如图所示（顶部）。通过密度计对条带的强度进行量化，并以HIF1α/β-肌动蛋白比率表示，n=3。16 h后HIF1α水平降低；n=3，***P<0.001（底部）。B类使用α-MMTG抗体在Raji-MTG16细胞的裂解物中通过Western印迹检测HIF1α的水平，所述细胞在缺氧条件下用4%的氧气和20ng/ml的多西环素或不加20ng/ml的多西环素孵育以诱导MTG16的合成。三个实验中有一个实验的吸液数据如图所示（顶部）。为了补偿常压下与缺氧相比HIF1α水平较低的情况，在20%O下进行的实验中，摄影胶片的曝光时间为60秒2（A） 相比之下，在4%O下进行的实验需要20秒2（B） ●●●●。通过密度测定法量化条带的强度，并用HIF1α/β-肌动蛋白比率表示。24 h后HIF1α水平降低；n=3，**P<0.01（底部）。
图8
图8。MTG16与PHD2相互作用并诱导HIF1α的泛素化和蛋白酶体降解。
答：。用HA-HIF1α和FLAG-泛素联合转染Raji-MTG16细胞，并在4%O培养48h2用20 ng/ml多西环素诱导产生MTG16。用抗α-HA抗体免疫沉淀细胞裂解液，然后用α-FLAG抗体免疫印迹法检测泛素化HIF1α，该蛋白在多西环素诱导的细胞中增加。中间面板显示MTG16通过α-HA而非α-β-actin共沉淀，作为阴性对照。下部面板显示HIF1α在全细胞裂解液中的输入。B。通过密度计量化A（顶部）中HIF1α-泛素带的强度，并表示为HIF1α-ubiquitin/β-actin比值。在多西环素孵育的细胞中，泛素化HIF1α水平升高；n=3，***P<0.001。C类细胞在4%O下孵育12小时2用20 ng/ml多西环素诱导产生MTG16。在全细胞裂解液中，MTG16和HIF1α与脯氨酰羟化酶D2（PHD2）共沉淀。D。通过对HIF1α（Hyp-564）中抗羟脯氨酸抗体的Western blotting检测，HIF1α的羟化作用在20 ng/ml多西环素（20%O）孵育4 h内被检测到2横坐标上的小时是指开始与多西环素孵育。MTG16诱导后HIF-1α随时间的预期下调。E.公司。实验还检测了HIF1α在4%O下的羟基化2在与20 ng/ml多西环素孵育期间。横坐标上的小时是指缺氧状态的开始。结果证实MTG16在4%O下使HIF1α中的Pro-564羟基化2.F类细胞在20%O下培养2加入或不加入20 ng/ml多西环素诱导产生MTG16，与蛋白酶体抑制剂MG132共同孵育24 h。抑制剂对HIF1α的降解具有强烈的保护作用。G公司在4%O下进行与F中相似的实验2结果证实，MG132对MTG16诱导的降解具有很强的保护作用。A、E和G的摄影胶片曝光时间为20秒，D和F的曝光时间为90秒。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Kumar P、Sharoyko VV、Spegel P、Gullberg U、Mulder H、Olsson I等（2013）转录共抑制因子髓系易位基因16抑制糖酵解并刺激线粒体呼吸。公共科学图书馆One 8:e68502 10.1371/journal.pone.0068502-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Rossetti S、Hoogeveen AT、Sacchi N（2004）《MTG蛋白质：染色质阻遏玩家与网络激情》。基因组学84:1-9。-公共医学
    1. Hunt A、Fischer M、Engel ME、Hiebert SW（2011）Mtg16/Eto2对小鼠T细胞发育有贡献。分子与细胞生物学31:2544–2551。10.1128/MCB.01458-10-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Lindberg SR，Olsson A，Persson AM，Olson I（2005）白血病相关ETO同源物在造血分化过程中的表达不同。实验血液学33:189–198。-公共医学
    1. Erickson P，Gao J，Chang KS，Look T，Whisenant E，Raimondi S，et al.（1992）T（8；21）急性髓性白血病断点的鉴定和融合转录物AML1/ETO的分离，与果蝇分割基因runt相似。《血液》80:1825-1831。-公共医学

出版物类型

MeSH术语

赠款和资金

这项工作得到了瑞典研究委员会（#K2011-11546，网址：www.vr.se/)瑞典癌症基金会（#11 0450，网址：www.cancerfonden.se/). 资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。