The nucleolar ubiquitin-specific protease USP36 deubiquitinates and stabilizes c-Myc

doi:10.1073/pnas.1411713112

.2015年3月24日；112(12):3734-9.

doi:10.1073/pnas.1411713112。 Epub 2015年3月9日。

核仁泛素特异性蛋白酶USP36去泛素化并稳定c-Myc

孙晓欣¹, 夏河², 李寅^三, Masayuki Komada公司⁴, 罗莎莉·西尔斯⁵, 穆水代⁵

附属公司

¹俄勒冈州波特兰市俄勒冈健康与科学大学医学院分子与医学遗传学系和OHSU奈特癌症研究所，邮编97239；
²江苏省南京市肿瘤医院医学院分子与医学遗传学系、放射肿瘤学系，210000；和。
^三江苏省肿瘤医院放射肿瘤科，南京210000；和。
⁴日本横滨东京理工学院生物科学系，226-8501。
⁵俄勒冈州波特兰市俄勒冈健康与科学大学医学院分子与医学遗传学系和OHSU奈特癌症研究所，邮编97239；daim@ohsu.edu searsr@ohsu.edu。

PMID： 25775507
预防性维修识别码：项目经理4378440
内政部： 10.1073/pnas.1411713112

核仁泛素特异性蛋白酶USP36氘化并稳定c-Myc

孙晓欣等。美国国家科学院程序. 2015.

.2015年3月24日；112（12）：3734-9。

doi:10.1073/pnas.1411713112。 Epub 2015年3月9日。

作者

孙晓欣¹, 夏河², 李寅^三, 小田正之⁴, 罗莎莉·西尔斯⁵, 穆水代⁵

附属公司

¹俄勒冈州波特兰健康与科学大学医学院分子与医学遗传学系和OHSU奈特癌症研究所，俄勒冈州97239；
²江苏省南京市肿瘤医院医学院分子与医学遗传学系、放射肿瘤学系，210000；和。
^三江苏省肿瘤医院放射肿瘤科，南京210000；和。
⁴日本横滨东京理工学院生物科学系，226-8501。
⁵俄勒冈州波特兰市俄勒冈健康与科学大学医学院分子与医学遗传学系和OHSU奈特癌症研究所，邮编97239；daim@ohsu.edu searsr@ohsu.edu。

PMID： 25775507
预防性维修识别码：项目经理4378440
内政部： 10.1073/pnas.1411713112

摘要

c-Myc蛋白的稳定性和活性受到泛素蛋白酶体系统的严格调控。c-Myc的异常稳定导致许多人类癌症。c-Myc被SCF（Fbw7）（一种SKP1-cullin-1-F-box复合物，包含F-box和WD重复域包含7，Fbw8，作为F-box蛋白）和其他几种泛素连接酶泛素化，而它被泛素特异性蛋白酶（USP）28去泛素化和稳定。c-Myc的大部分降解似乎发生在细胞核中。然而，c-Myc是否受到核仁中氘化的调节尚不清楚。在这里，我们报道核仁氘化酶USP36是一种新的c-Myc氘化酶类。USP36在细胞和体外与c-Myc相互作用并氘化c-Myc，导致c-Myc的稳定。这种USP36对c-Myc的调节发生在细胞核中。有趣的是，USP36与核仁Fbw7γ相互作用，但与核质Fbw6α不相互作用。然而，它消除了Fbw7γ和Fbw6α介导的c-Myc降解。一致地，USP36的敲低降低c-Myc的水平并抑制细胞增殖。我们进一步证明USP36本身是c-Myc靶基因，表明USP36和c-Myc形成正反馈调节环。USP36的高表达水平存在于人类乳腺癌和肺癌的子集中。总之，这些结果确定USP36是控制c-Myc核仁降解途径的关键和善意的氘化酶。

关键词：USP36；c-Myc；氘化；核仁；无处不在。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

**图1。**
USP36氘化并稳定c-Myc。(A类)过度表达WT USP36而非C131A突变体会诱导c-Myc水平。用IB检测转染对照或Flag-USP36（WT或C131A突变体）的HeLa细胞(B)USP36稳定内源性c-Myc。用50μg/mL环己酰亚胺（CHX）处理转染所示质粒48 h的HeLa细胞。在不同时间点采集细胞并用IB进行分析(C类)USP36在细胞中去泛素化c-Myc。在收获前，用MG132处理转染有所示质粒的HEK293细胞6小时。使用镍将细胞拉下（PD）²⁺-NTA珠在变性条件下，然后是IB。星号表示天然c-Myc的非特异性PD。(D类)敲除USP36可增加c-Myc泛素化。用打乱或USP36 siRNA连同或不连同His-Ub转染HeLa细胞48 h，并用MG132处理6 h。细胞用镍离子探针进行PD处理²⁺-NTA珠，其次是IB(E类)USP36氘化物c-Myc体外研究。使用抗Flag亲和纯化法从转染His-Ub和Flag–c-Myc的293细胞中纯化泛素化c-Myc。泛素化c-Myc与重组WT-His-USP36孵育^1-800或其C131A突变蛋白，其次是带有抗标记抗体的IB。

**图2。**
USP36在细胞和体外与c-Myc相互作用。(A类和B)异位USP36与异位c-Myc的Co-IP。转染V5–c-Myc和Flag-USP36的H1299细胞(A类)或V5-USP36和Flag–c-Myc(B)单独或一起用co-IP进行分析。(C类)内源性USP36和c-Myc之间的Co-IP。293细胞的裂解物通过与抗c-Myc（Y69）或对照IgG的共-IP进行测定。(D类和E类)USP36的N末端USP结构域需要与c-Myc结合。用co-IP和抗Flag抗体检测转染V5-c-Myc和对照或Flag-USP36（WT或缺失突变体）的HEK293细胞(D类). Flag-USP36及其缺失突变体的示意图如所示E类. (F类)USP36在体外与c-Myc相互作用。用纯化的His–c-Myc培养固定在谷胱甘肽珠上的纯化GST或GST-USP36。用IB和抗Myc检测结合蛋白(顶部)和反GST(底部).

**图3。**
USP36与Fbw7γ相互作用，但不与Fbw7α相互作用；抑制Fbw7γ或Fbw7-α介导的c-Myc降解；和氘化核仁中的c-Myc。(A类)免疫荧光（IF）染色。转染Flag-USP36、Flag-Fbw7γ或Flag-Fbw7α的HeLa细胞用抗Flag（绿色）和抗核蛋白（NS）（红色）进行免疫染色。(B)USP36与Fbw7γ相互作用，但与Fbw7α不相互作用。用co-IP检测转染有指示质粒的HeLa细胞。(C类)USP36与c-Myc和Fbw7γ形成复合物。转染Flag-Fbw7γ、V5-USP36和c-Myc的HeLa细胞经IP和抗Flag处理，然后用Flag肽洗脱。然后将洗脱液与对照IgG或抗V5进行co-IP。(D类和E类)USP36抑制Fbw7γ或Fbw6α介导的c-Myc降解。用IB检测转染有指示质粒的HeLa细胞(F类)USP36与核仁中的c-Myc相互作用。如图S3所示，从表达Flag-USP36的HeLa细胞中分离出的核仁部分E类通过co-IP分析。(*G公司*)USP36氘化物在核仁中c-Myc。从转染了所示质粒的HeLa细胞中分离出的核仁用镍测定²⁺-NTA PD(*H（H）*)USP36的过度表达增加了核质和核仁中c-Myc的水平。不使用或使用强力霉素（dox）诱导HeLa–TO（四环素操作员）–Flag-USP36细胞12 h，并通过细胞分馏和IB进行分析。

**图4。**
敲除USP36可降低c-Myc水平并抑制细胞增殖。(A类和B)敲除USP36可降低c-Myc水平。希拉牌手表(A类)和MCF10A(B)细胞被扰乱或USP36 shRNA编码慢病毒感染。通过IB测定细胞裂解物中c-Myc和USP36的表达(C类)敲除USP36抑制细胞增殖。HeLa或MDA-MB-231细胞被对照或USP36 shRNA编码慢病毒感染。细胞培养3周。用结晶紫染色观察菌落。(*D–F型*)敲除c-Myc不会进一步增加敲除USP36对细胞增殖的抑制作用。对单独或联合感染对照、USP36 shRNA或c-Myc shRNA编码慢病毒的HeLa细胞进行集落形成分析(D类)或使用培养系统测量细胞随时间的汇合(F类). USP36和c-Myc表达的代表性IB检测显示于E类. (*G公司*)敲低USP36可诱导细胞凋亡。用碘化丙啶（PI）对感染对照或USP36 shRNA编码慢病毒的HeLa细胞进行染色，然后进行流式细胞术分析。显示了亚G1细胞的平均百分比。(*H（H）*)软琼脂集落形成试验。用对照或USP36 shRNA编码慢病毒感染MDA-MB-231乳腺癌细胞株，然后在软琼脂中进行集落形成试验。

**图5。**
USP36是c-Myc的靶基因。(A类)c-Myc诱导USP36的表达。293-TO-Myc细胞在dox存在下培养不同时间，如图所示，然后是IB(B和C类)血清刺激后细胞中USP36和c-Myc的动态表达。在含有0.2%FBS的培养基中培养48 h的HeLa细胞用20%FBS刺激并在指定的时间点收获。通过IB检测细胞USP36的表达(B)或RT-qPCR分析(C类). (D类)的示意图*美国药典36*基因外显子-内含子区域。条形图表示ChIP–qPCR分析扩增的四个区域。红色方框和星号分别表示规范和非规范E方框。填充框表示外显子。还显示了外显子的数量。箭头表示转录开始。(E类)c-Myc特异性地结合到包含E盒的外显子1和内含子1，而不是内含子6美国药典36基因。使用对照IgG或抗c-Myc抗体对HeLa细胞进行ChIP处理，然后对所示基因组区域进行qPCR扩增*美国药典36*基因。(F类)血清刺激增加c-Myc与*美国药典36*基因。HeLa细胞血清饥饿48小时，然后用20%FBS刺激2小时，如B对血清饥饿和再刺激的细胞进行ChIP–qPCR，以检测USP36启动子DNA（外显子1）。(*G公司*)敲除内源性c-Myc可降低USP36水平。用IB检测转染c-Myc或干扰siRNA的HeLa细胞。

**图6。**
USP36在癌细胞中过度表达。(A类和B)USP36在乳腺癌细胞系中过度表达。采用RT-qPCR方法检测USP36在10个乳腺癌细胞系中的表达(A类)和IB(B)与永生化乳腺上皮细胞MCF10A进行比较。(C类和D类)USP36在一部分原发性乳腺癌中过度表达。采用RT-qPCR检测乳腺癌患者组织和患者匹配的正常邻近组织中USP36 mRNA的表达(C类). USP36表达平均增加2.19倍，如D类. (E类)说明USP36在调节核仁中c-Myc的作用的示意图（参见讨论详细信息）。

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