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.2015年3月2日12时18分。
doi:10.1186/s12950-015-0061-8。 2015年电子收集。

MicroRNA-181b通过靶向巨噬细胞RAW264.7细胞中的IL-6调节内毒素耐受

附属公司

MicroRNA-181b通过靶向巨噬细胞RAW264.7细胞中的IL-6调节内毒素耐受

张文军(Wenjun Zhang)等。 J Inflamm(伦敦). .

摘要

白细胞介素6(IL-6)是一种主要的促炎细胞因子,IL-6的失调与许多炎症疾病有关。内毒素诱导的IL-6耐受是避免过度免疫反应的重要机制。但迄今为止,IL-6内毒素耐受的分子机制尚不清楚。在此,我们报告了在LPS刺激后,IL-6分泌和microRNA-181b(miR-181b)表达呈负相关。我们还证明,靶向IL-6转录物3'-UTR的miR-181b和miR-181的上调与NF-kB相关。我们进一步证明,诱导巨噬细胞IL-6耐受需要上调miR-181b对LPS的反应。我们的结果表明,miR-181b介导的转录后控制可能参与微调内毒素耐受中IL-6表达的临界水平。

关键词:内毒素耐受性;IL-6;LPS;巨噬细胞;miR-181b。

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数字

图1
图1
miR-181b和IL-6在LPS诱导的RAW264.7细胞耐受过程中差异表达。(A)RAW264.7细胞用100 ng/ml LPS(第1 LPS)连续预处理24 h,用PBS洗涤两次,细胞在新鲜完整培养基中用100 ng/ml LPS培养12 h。ELISA法测定总(细胞内和分泌的)IL-6蛋白水平。(B)miRanda和RNA22预测靶向IL-6 3′-UTR的miRNAs。miRanda和RNA22预测的miRNAs用三角形标记。(C)RAW264.7细胞按(A)miR-181a、miR-181b、miR-81c和let-7 g通过qRT-PCR测定。样品数据归一化为U6 mRNA。样品分析一式三份。数据代表平均值±来自至少三个独立实验的S.D。
图2
图2
miR-181b直接靶向IL-6基因。(A)miR-181b及其在IL-6的3′-UTR中的假定结合序列。突变序列以粗体显示。(WT:野生型;MUT:突变型)。(B、C)荧光素酶活性分析。(B)HEK-293细胞和(C)用miR-181b抑制剂或阴性对照抑制剂、pRL-TK和含有IL-6基因3′UTR的萤火虫荧光素酶报告质粒共同转染RAW264.7细胞。pRL-TK被联合转染作为内部对照,以纠正转染和收获效率的差异。将每个样品的萤火虫荧光素酶活性归一化为Renilla荧光素酶活性。阴性对照抑制剂的归一化荧光素酶活性分别设置为相对荧光素素酶活性1。(D)miR-181b抑制剂对内源性IL-6 mRNA水平的影响。用miR-181b抑制剂或阴性对照抑制剂共同转染RAW264.7细胞。转染24 h后,用100 ng/ml LPS连续刺激细胞6 h和12 h,然后分离细胞,用qPCR分析IL-6的表达。(E)miR-181b抑制剂对内源性IL-6蛋白水平的影响。用miR-181b抑制剂或阴性对照抑制剂转染细胞24 h后,用100 ng/ml LPS连续刺激细胞6 h和12 h,然后分离细胞。用ELISA法分析RAW264.7细胞。NC:阴性对照;一: 抑制剂。数据以Student的t吨-测试*第页 < 0.05, **第页 < 0.01.
图3
图3
LPS耐受中miR-181b的上调依赖于NF-kB。(A)用100 ng/ml LPS连续刺激RAW264.7细胞12 h和24 h。通过qRT-PCR测定pri-miR-181b。样品数据标准化为β-肌动蛋白mRNA。(B、C)p65 siRNA或阴性对照siRNA转染后RAW264.7细胞p65的qRT-PCR和western blots。β-actin作为内部对照。(D)用p65 siRNA或阴性对照siRNA转染RAW264.7细胞,24 h后,用100 ng/ml LPS连续刺激细胞12 h和24 h。通过qRT-PCR测定pri-miR-181b。样本数据归一化为β-肌动蛋白mRNA。(E)一组引物用于qPCR分析,以跨越miR-181b的潜在启动子区域。(F)用100 ng/ml LPS连续刺激RAW264.7细胞24小时。通过ChIP分析对miR-181b启动子区p65结合进行qPCR分析。NC:阴性对照。数据以Student的t吨-测试*第页 < 0.05, **第页 < 0.01.
图4
图4
miR-181b抑制剂可消除LPS诱导的IL-6耐受性。(A)TSA对LPS耐受期间内源性IL-6蛋白水平的影响。RAW264.7细胞用100 ng/ml LPS连续预处理24 h,用PBS洗涤两次,然后用1μM TSA和100 ng/ml LPS预处理细胞。再分别于6h和12h后,用ELISA法检测IL-6。用100 ng/ml LPS连续刺激细胞24 h,用PBS洗涤两次,然后用miR-181b抑制剂转染细胞,并用100 ng/ml LPS刺激细胞。6小时和12小时后,用qRT-PCR分析miR-181b(B)ELISA检测IL-6(C) ●●●●。NC:阴性对照;一: 抑制剂。数据以Student的t吨-测试**第页 < 0.01, ***第页 < 0.001.(B,CcpmiR-181b抑制剂对LPS耐受期间内源性IL-6蛋白水平的影响。RAW264.7。

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