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.2015年2月12日；518(7538):258-62.
doi:10.1038/nature14184。 Epub 2015年2月2日。

同源重组缺陷肿瘤依赖于Polθ介导的修复

拉斐尔·塞卡尔迪 1, 杰西卡·C·刘 2, 拉文德拉·阿穆努加马 三, 伊尔迪科·哈伊杜 4, 本杰明·普里马克 1, 马克·I·R·佩塔科林 5, 凯文·奥康纳 1, Konstantinopoulos甲型泛神经炎 6, 斯蒂芬·J·埃尔奇 4, 西蒙·博尔顿 5, 帖木儿·优素福扎伊 7, 艾伦·D·安德里亚 1
附属公司

同源重组缺陷肿瘤依赖于Polθ介导的修复

拉斐尔·塞卡尔迪等。 自然. .

摘要

大规模基因组研究表明，一半上皮性卵巢癌（EOC）的同源重组（HR）修复基因发生改变。HR的丢失是EOC基因组不稳定的原因，也是EOC细胞对替代性多聚腺苷核糖聚合酶（PARP）介导的DNA修复机制高度依赖的原因。先前的研究表明，DNA聚合酶θ（Polθ，也称为POLQ，由POLQ编码）是修复DNA双链断裂所需的一种途径，称为易出错的微同源介导末端连接（MMEJ）途径。Polθ是否与典型的DNA修复途径相互作用以防止基因组不稳定尚不清楚。在这里，我们报告了EOC中HR活性和Polθ表达之间的负相关。HR产生细胞中Polθ的敲除上调HR活性和RAD51核丝组装，而HR缺乏EOC中Polδ的敲除则加剧细胞死亡。与这些结果一致，HR基因（Fancd2）和Polq在小鼠中的基因失活导致胚胎死亡。此外，Polθ含有RAD51结合基序，并阻断RAD51介导的重组。我们的研究结果揭示了HR途径和Polθ介导的EOCs修复之间的合成致死关系，并确定Polθ是一种新的癌症治疗药物靶点。

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数字

扩展数据图1
扩展数据图1。POLQ在上皮性卵巢癌（EOCs）中高度表达，POLQ的表达与HR基因的表达相关
转基因合成（TLS）表达的基因集富集分析（GSEA）(一)和聚合酶(b条)来自19种不同癌症类型的28个独立数据集中，原发癌和对照样本之间的基因。使用秩度量分数来比较癌症和对照样品之间的表达值，确定富集值（在定义的数据集中表示为每个基因的单个点）。虚线上方的点反映了癌症样本中的富集，而虚线下方的点显示了对照样本中的基因表达富集。数据集根据秩度量分数的幅度进行排序，并如图所示绘制。c、，POLQ基因在19种不同癌症类型的40个独立数据集中的表达。对于每个数据集，POLQ值表示为相对于对照样品平均表达的折叠式变化差异，该差异被任意设置为1。日期：，POLQ的表达与卵巢TCGA中的肿瘤分级和MKi67基因表达相关（n=494例卵巢癌患者（1级，n=5；2级，n=61；3级，n=228）。e、，POLQ表达与卵巢数据集GSE9891中肿瘤分级MKi67基因表达相关（n=251例卵巢浆液性和子宫内膜癌患者，分级状态可用（1级，n=20；2级，n=88；3级，n=143））。使用Pearson检验评估统计相关性（对于d:r=0.65，对< 10-3; 对于e:r=0.77，对< 10-3).f、，高水平POLQ（高POLQ，1标准33%，n=95），相对于卵巢数据集GSE9891中POLQ低表达的样本（低POLQ，67%，n=190）（n=285名卵巢癌患者）。通过超几何检验，使用两组（高POLQ和低POLQ）之间200个差异表达最大的探针确定显著性值。克，GSEA用于5个独立卵巢癌数据集中原发癌和对照样本之间DNA修复基因的表达。GSE14407显示了卵巢癌和对照组之间差异基因表达的典型热图。对于每个数据集，DNA修复基因根据反映其在癌症样本中富集程度的度量分数进行排序。右侧显示了主要在癌症样本中表达的前20个DNA修复基因与对照样本的比较。小时，在40个独立的癌症数据集中，GSEA用于（g）中定义的原发癌和对照样本之间的前20个DNA修复基因。标称值对-该值被用作癌症样本中表达丰度的度量，并表示为瀑布图。当对照样品中的基因集表达增加时对-值被任意设置为1。我，在来自卵巢数据集GSE9891的285个样本中，POLQ表达与RAD51和FANCD2基因表达相关。使用皮尔逊检验评估统计相关性（r=0.71，对< 10-3).j中，CCLE收集的1046个细胞系中与POLQ表达最密切相关的前10个基因（基因邻接分析）。表中显示了这些基因的DNA修复活性。已知HR基因表达增加与铂类化疗（HR缺乏的替代物）的反应改善呈正相关，因此可以预测HR活性降低,概念上，HR缺乏状态可能导致其他HR基因的代偿性表达增加。k、，扩展数据图1g中定义的前20个DNA修复基因编码的分子功能的顶级基因本体论（GO）术语。l中，POLQ结构域的示意图，带有与POLQ共同表达的解旋酶（BLM、RECQL4、RAD54B和RAD54L）（来自扩展数据图1g）。显示了ATP结合和水解基序（即Walker A和B）的保守氨基酸序列。c中的Cox图显示了二十五到七十五个百分点，线条表示中值，胡须表示最小和最大值。对于d日和e（电子）（顶部面板），每个点代表一名患者的表达值，括号显示平均值±标准误差。
扩展数据图2
扩展数据图2。POLQ是维持基因组稳定性所需的RAD51相互作用蛋白
a、，siRNA序列（siPOLQ1和siPOLQ）有效下调外源性转染的POLQ蛋白。用Flag或POLQ抗体免疫印迹法（左）和用2组不同的POLQ引物RT-qPCR（右）检测POLQ水平。免疫印迹上的星号表示非特异性带。使用GAPDH作为参考基因对表达进行标准化。POLQ基因表达值显示为相对于对照细胞平均表达的折叠变化差异，该差异被任意设置为1。b、，量化转染有指示siRNA的U2OS细胞中基线和HU诱导的RAD51病灶。c、，定量转染有指示siRNA的U2OS细胞中基线和HU诱导的γH2AX病灶。日期：，定量转染有指示siRNA的BrdU阳性U2OS细胞中IR诱导的RAD51病灶。e、，在3天生存试验中，siRNA对POLQ的抑制导致MMC处理的293T细胞的细胞存活率降低。f、，用指示的siRNA转染293T细胞的染色体畸变定量。克，用于RAD51相互作用研究的POLQ截断蛋白的示意图。小时，内源性RAD51与标记的POLQ-ΔPol1（POLQ-1-1416）共沉淀，但不与POLQ-1633-Cter共沉淀，每个都在HeLa细胞中稳定表达。我，RAD51相互作用基序之间的序列比对秀丽线虫RFS-1和人类POLQ。j中，的示意图POLQ公司结构域及其同系物HELQ公司和波兰所有数据均显示平均值±标准误差。
扩展数据图3
扩展数据图3。POLQ中RAD51相互作用基序的表征
a、，用重组RAD51探针检测取代肽阵列并进行免疫印迹分析。产生横跨每个RAD51结合位点的20聚体肽（如图所示）。1g），其中原始肽的每个氨基酸突变为20个氨基酸中的每个，并测试RAD51结合活性。POLQ的RAD51相互作用域的每个氨基酸的氨基酸变化如右图所示。Ponceau染色用于可视化肽在阵列中的位置。b、，GST-RAD51下拉菜单在体外-翻译的POLQ蛋白缺失表明氨基酸。c、，互补研究中使用的POLQ突变体示意图。日期：，定量与空载体（EV）或POLQ-ΔPol1 cDNA稳定整合的U2OS细胞中IR诱导的RAD51病灶，该cDNA对siPOLQ1不敏感。用指示的siRNA转染细胞，然后用IR处理。计算RAD51病灶超过10个的细胞数量（相对于对照细胞（si-Scr））。e、，在与空载体（EV）或指示POLQ cDNA稳定整合的U2OS细胞中进行DR-GFP检测，构建对siPOLQ1不敏感的cDNA，并转染指示的siRNA。所有数据均显示平均值±标准偏差。
扩展数据图4
扩展数据图4。POLQ是一种ATP酶，抑制RAD51-ssDNA核丝组装和RAD51依赖的D环结构的形成
a、，代表性ΔPol2 WT辐射ATP酶分析。b条用ΔPol2 WT和ssDNA进行凝胶迁移率变化分析。c、，考马斯染色凝胶显示纯化的ΔPol2-A死亡片段。日期：，代表性ΔPol2-A-dead放射ATP酶分析。e、，ΔPol2-A-dead ATP酶活性的定量。（ssDNA：单链DNA；dsDNA：双链DNA）。f、，在ΔPol2 WT含量增加的情况下组装/破坏RAD51-ssDNA细丝。上述说明了每个组分添加到反应中的顺序。克，RAD51相关D回路结构的形成示意图。小时增加ΔPol2 WT后，形成含RAD51的D环结构。我，增加ΔPol2 WT后形成的D-loop分数。j中，POLQ表达水平和HR状态对顺铂或PARPi肿瘤敏感性的影响。数据输入我显示平均值±标准误差。
扩展数据图5
扩展数据图5。POLQ在复制应激下发挥作用，并由HR缺乏引起
a、，染色质的POLQ募集通过紫外线处理得到增强。与标记的ΔPol1或POLQ-1633-Cter（扩展数据图2g）稳定整合的HeLa细胞接受紫外线处理。在紫外线处理后的指定时间点收集细胞，对细胞核和染色质部分进行IP。b、，用紫外线处理与ΔPol1稳定整合的HeLa细胞，并在紫外线暴露后的指定时间点收获。紫外线处理增强了POLQ和RAD51的共沉淀。c、，从WT或波尔克-/-MEF公司。日期：，从WT或波尔克-/-转染EV或POLQ cDNA构建物的MEF。e、，采用RT-qPCR方法分析HR缺乏卵巢癌细胞株（PEO-1和UWB1-289）中POLQ基因的表达，并与其他卵巢癌细胞系、宫颈癌细胞HeLa和转化人胚肾细胞293T进行比较。以GAPDH基因为参考，对表达进行标准化。POLQ表达值显示为相对于HR阳性对照细胞中平均表达的折叠式变化，其被任意设置为1。f、， POLQ公司siRNA靶向转染293T细胞的基因表达分析风扇CD2,巴西航空公司1或巴西航空公司2（左侧面板）和相对于FANCD2-缺陷电池（PD20）（右侧面板）的校正PD20电池（PD20+FANCD2）。以GAPDH基因为参考，对表达进行标准化。POLQ表达值表示为相对于对照细胞平均表达的折叠式变化，其被任意设置为1。克，POLQ基因在5个浆液性上皮性卵巢癌数据集（通常与HR缺乏相关）和1个透明细胞卵巢癌数据集中的表达（与HR改变无关的亚组）。对于每个数据集，POLQ表达式值显示为相对于控制样本中平均表达式的折叠式变化差异，该平均表达式被任意设置为1。小时，卵巢癌患者一线铂类化疗（卵巢癌TCGA）后的无进展生存期（PFS）。统计显著性由原木-横木测试(对< 10-2).我，siPOLQ和不同POLQ cDNA结构对HR读数的影响。NA：不适用。方框图c、 日期：，和克显示百分之二十五到七十五，线条表示中值，胡须表示最小和最大值。数据输入e（电子）和（f）显示平均值±s.e.m。
扩展数据图6
扩展数据图6。POLQ抑制使HR缺乏肿瘤对细胞毒性药物的敏感性
表达抗FANCD2或BRCA2的Scrambled（Scr）shRNA或shRNA的A2780细胞的克隆原性形成，同时增加MMC量(一)，紫外线(b条)或IR(c（c）). 在CDDP浓度增加的情况下，表达Scrambled（Scr）或FANCD2 shRNA的A2780细胞与靶向POLQ的shRNA的克隆形成(d日)、多媒体卡(e（电子）)或PARPi(（f）).克，抑制POLQ可降低A2780细胞3天后的存活率 连续暴露于ATM抑制剂Ku55933的天数。小时，提示MMC脉冲治疗后24小时，对表达FANCD2 shRNA和靶向POLQ或Scr的siRNA的A2780细胞进行免疫印迹分析。我，用全基因组shRNA文库感染FANCA缺失的成纤维细胞（GM6418），并用MMC治疗7天。MMC治疗后，通过对治疗前感染细胞的测序，确定每个shRNA的折叠变化富集度。已知TP53耗竭可提高FANCA的存活率-/-细胞。最近研究表明，WRN耗竭对HR缺乏具有综合致死性。每列表示至少2个独立shRNA的平均值。所有数据均显示平均值±标准误差。
扩展数据图7
扩展数据图7。HR和POLQ修复途径是综合致命的体内
a、，杂交后代的基因型频率范迪2+/−波尔克+/−老鼠。Ψ：四范迪2-/-波尔克-/-观察到后代在出生后48小时内有几种先天性畸形和过早死亡。b、，的描述范迪2−/−波尔克−/−研究中产生的后代。后代出现先天畸形（即眼睛缺陷），同时体型和体重下降。箭头表示没有右眼。c、，杂种E13.5至E15胚胎（交配后13.5至15天）的基因型频率范迪2+/负极波尔克+/−老鼠。日期：，E13.5至E15中观察到的先天畸形及其测量频率的描述范迪2−/−波尔克−/−研究中产生的胚胎。e、，克隆形成重量,范迪2-/-,波尔克-/-和范迪2−/−波尔克−/−PARPi浓度增加的MEF。f、，用指示的shRNAs转导A2780细胞并异种移植到裸鼠两侧。每两周测量一次单个小鼠的肿瘤体积，持续8周。每组代表来自n≥5只小鼠的n≥5个肿瘤。克，用载体或PARPi治疗的肿瘤中Ki67和γH2AX的定量。小时，用载体或PARPi治疗的裸鼠体内表达sh-Scr或sh-POLQ的A2780-shFANCD2异种移植物的代表性Ki67和γH2AX染色。比例尺，100μM。我， 体内竞争分析设计。j中，特定条件下异种移植后的肿瘤嵌合。k、，异种移植前（FACS分类后）或异种移植后（PARPi）肿瘤的代表性流式细胞术分析。显示了GFP-RFP细胞的百分比。l中，特定条件下异种移植后的肿瘤嵌合。对于中的数据j个和l中，每个圆圈代表一个肿瘤的数据，每组代表n≥6只小鼠的n≥7个肿瘤。括号中显示平均值±标准误差电子-克显示平均值±标准误差（f）每组代表n≥6只小鼠的n≥6个肿瘤。
扩展数据图8
扩展数据图8。POLQ是HR缺陷细胞生存所必需的，并限制HR缺陷细胞中RAD51结构的形成
a、，克隆形成范迪2-/-波尔克-/-在PARPi浓度增加的情况下，转染全长POLQ cDNA构建的MEF。b、，FANCD2缺失细胞的染色体断裂分析，这些细胞首先转染了指示的siRNA和全长POLQ cDNA构建物，对siPOLQ1不敏感，然后暴露于MMC。c、，对转染有指示siRNA的U2OS细胞进行DR-GFP分析。日期：，量化转染有指示siRNA的U2OS细胞中基线和IR诱导的RAD51病灶。e、，紫外线处理增强了RAD51对染色质的补充。Vu423细胞（BRCA2-/-)在紫外线处理和对细胞质、细胞核和染色质部分进行免疫印迹后的指定时间点收集。f、，Vu423细胞中RAD51对染色质的补充（BRCA2-/-)用指示的siRNA转染。组蛋白H3用作染色质分离的对照。所有数据均显示平均值±标准误差。
扩展数据图9
扩展数据图9。POLQ参与易出错的DNA修复
a、，对转染有指示siRNA和/或经PARPi处理的U2OS细胞进行末端连接报告分析。b、，对转染有指定siRNA和POLQ cDNA的U2OS细胞进行末端连接报告分析，构建对siPOLQ1不敏感的结构。c、，紫外线损伤诱导U2OS细胞形成POLQ灶。PARPi预处理可消除POLQ病灶。日期：，测定从siRNA-处理的293T细胞中恢复的受损supF质粒的突变频率。e、，卵巢、子宫和乳腺TCGA中的非同义突变计数。所有数据均显示平均值±标准误差。
扩展数据图10
扩展数据图10。描述POLQ在DNA修复中作用的模型
a、，POLQ如何限制RAD51-ssDNA灯丝组装的机械模型。根据该模型，POLQ的ATP酶结构域可能通过消耗局部ATP浓度来阻止RAD51单体组装成RAD51聚合物。POLQ中心区域的RAD51结合域可能会隔离RAD51单体，从而阻止纤维组装。b、 一、。在生理条件下，POLQ的表达较低，对DNA双链断裂（DSB）的表达影响有限。二、。当HR缺乏发生时，POLQ高度表达，并引导DSB向alt-EJ修复。三在HR缺陷的情况下，POLQ的丢失通过毒性RAD51中间体的持续存在和alt-EJ的抑制导致细胞死亡。
图1
图1。POLQ是一种抑制HR的RAD51相互作用蛋白
a、，对转染有指示siRNA的U2OS细胞进行DR-GFP分析。b、，定量转染有指示siRNA的U2OS细胞中的RAD51病灶。c、，内源性RAD51共沉淀体内用全细胞提取物纯化的全长标记POLQ。日期：，使用全长标记POLQ进行GST下拉实验。（*：非特异性带）。e、，GST-RAD51下拉菜单体外翻译POLQ截断突变体。f、，GST-RAD51下拉式体外翻译的POLQ版本缺少指定的氨基酸。克，用重组RAD51对所示POLQ基序的肽阵列进行Ponceau染色和免疫印迹。显示了跨越RAD51相互作用基序的POLQ氨基酸。数据输入一和b条表示平均值±标准误差。
图2
图2。POLQ抑制RAD51介导的重组
a、，互补研究中使用的POLQ突变体及其与RAD51的相互作用示意图。b、，定量转染有指定siRNA和POLQ cDNA构建物的U2OS细胞中对siPOLQ1不敏感的RAD51病灶。c、，对转染有指定siRNA和POLQ cDNA的U2OS细胞进行DR-GFP分析，构建对siPOLQ1不敏感的结构。日期：，纯化POLQ片段的考马斯染色凝胶。e、，POLQ ATP酶活性的定量。f、，POLQ与ssDNA和dsDNA结合的定量。g、 RAD51-ssDNA核丝组装分析。小时，RAD51依赖性D环形成的评估。数据输入b、 c、e和（f）表示平均值±标准误差。
图3
图3。POLQ促进S相进展和失速叉的恢复
a、，HR缺乏癌症亚型中POLQ基因的表达。b、，A2780细胞暴露于指定的DNA损伤剂后的存活分析。免疫印迹显示沉默效率。c、，DNA损伤剂脉冲治疗后的免疫印迹分析（*γH2AX：见方法）。日期：，同步化A2780细胞的细胞周期进展。具有代表性的细胞周期分布。e、，通过EdU掺入测量的循环A2780细胞的分数。f、，DNA纤维长度的量化。克，失速叉的百分比。中显示的所有实验a-d公司在两个细胞系（A2780和293T）中进行。除（f）这显示了百分之二十五到七十五，线条表示中值，胡须表示最小值和最大值。
图4
图4。HR和POLQ修复途径之间的合成致命性
a、，表达指示cDNA和指示shRNA的BRCA1缺陷（MDA-MB-436）细胞的克隆形成。b、，转染所示siRNA的HR缺陷细胞的染色体断裂分析。显示了具有代表性的图像。箭头表示染色体畸变。c、，妊娠第14天的胚胎。日期：，指定异种移植物的生长体内免疫印迹显示沉默效率。e、，接受治疗的单个小鼠的相对肿瘤体积（RTV）（d）治疗三周后。f、，用载体或PARPi治疗的小鼠的总体存活率。原木库对< 10-3个.克隆形成（g）和染色体断裂分析（h）表达对siPOLQ1不敏感的POLQ cDNA构建体并用所指示的siRNA转染的BRCA2缺陷细胞的表达。我，转染指定siRNA的BRCA2缺陷细胞的克隆形成。j中，POLQ在DNA修复中的作用模型。数据输入a、 b、g和我表示平均值±标准误差d-f型，每个圆圈代表一个肿瘤的数据，每组代表n≥6只小鼠的n≥7个肿瘤。括号显示平均值±s.e.m。
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