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.2015年3月；35(3):412-23.
doi:10.1038/jcbfm.2014.207。 Epub 2014年12月17日。

脑内皮细胞miR-146a通过抑制多个靶点抑制NF-κB活化来负向调节T细胞粘附

吴东胜 1, 卡米拉·塞鲁蒂 1, 米盖尔·洛佩兹·拉米雷斯 2, 加雷思·普莱斯 三, 乔什·金·罗布森 三, 朱莉·辛普森 4, 苏珊娜·马·范德波尔 5, 马克·C·赫斯特 1, 赫尔加·E·德·弗里斯 5, 巴兹尔·沙拉克 6, 大卫·贝克 三, David K男 1, 格雷戈里·J·迈克尔 三, 伊格纳西奥·罗梅罗 1
附属公司

脑内皮细胞miR-146a通过抑制多个靶点抑制NF-κB活化来负向调节T细胞粘附

吴东胜等。 大脑血流代谢杂志. 2015年3月.

摘要

炎症前细胞因子诱导的核因子NF-κB活化在白细胞粘附到脑内皮细胞（BEC）以及随后的迁移中起着重要作用，这对于多发性硬化（MS）等神经炎症疾病的发展至关重要。相反，microRNA-146a（miR-146a）通过抑制各种细胞类型的NF-κB活性而成为一种抗炎分子，但其在神经炎症期间对BEC的影响尚待评估。在这里，我们发现miR-146a在MS活性病变的微血管和实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的脊髓中上调。体外，TNFα和IFNγ处理人脑微血管内皮细胞（hCMEC/D3）导致miR-146a上调。miR-146a的脑内皮过度表达减少，而miR-146 a的敲除增加了细胞因子刺激的T细胞与hCMEC/D3细胞的粘附，NF-κB的核移位，以及hCMEC/D3细胞中粘附分子的表达。此外，脑内皮细胞miR-146a通过靶向两种新的信号转导子调节NF-κB活性，即RhoA和活化T细胞5的核因子，以及先前确定的分子IL-1受体相关激酶1和TNF受体相关因子6。我们提出脑内皮miR-146a作为BECs中的内源性NF-κB抑制剂，与神经炎症过程中白细胞粘附减少有关。

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数字

图1
图1
炎症期间，中枢神经系统微血管和培养的脑内皮细胞中miR-146a增加。(A类)从正常白质（NAWM）和MS活动性病变中通过激光捕获显微切割分离的脑内皮细胞中miR-146a的定量RT-PCR分析(n个=6). 数据显示miR-146a相对丰度归一化为小核RNA U6B。P（P）=0.039（成对学生）t吨-测试。(B类)采用定量RT-PCR分析miR-146a在酶消化分离的小鼠脊髓微血管中的表达。将三只小鼠的样品合并为一只，每组使用九只小鼠。正常对照Biozzi ABH小鼠；APP、EAE小鼠急性期瘫痪，第17天临床评分为4分；缓解，EAE小鼠在第一个缓解阶段的临床得分为0.5，第28天体重增加。数据表示平均值±标准误差。，n个=3, ***P（P）通过方差分析（ANOVA），与正常或缓解相比<0.001。(C类)典型的显微照片显示我n原位结合免疫组织化学杂交，分别在EAE诱导后第10天（D10，上面板）小鼠或第17天（下面板）EAE-APP小鼠的PECAM-1阳性脊髓微血管中miR-146的表达。左侧面板显示miR-146a的表达（红色箭头）。中间面板显示内皮特异性标记物PECAM-1的免疫染色（白色箭头）。右侧面板显示合并的图像，以演示miR-146a和PECAM-1的共同定位（红色箭头）。Hoechst 33342标记细胞核（浅蓝色）。比例尺，25 μ米(天)将脑内皮细胞系hCMEC/D3细胞融合并使其不受刺激或用1 肿瘤坏死因子（ng/mL）α和干扰素γ持续0.5、6、24或48小时。用定量RT-PCR分析miR-146a的表达，并将其归一化为小核RNA U6B。非刺激细胞的值设为1。数据表示平均值±标准误差。，n个=3, *P（P）<0.05, **P（P）通过方差分析，与未治疗的对照组相比<0.01。中枢神经系统；实验性自身免疫性脑脊髓炎急性期麻痹；干扰素γ,干扰素γ；miR，microRNA；MS，多发性硬化；逆转录聚合酶链反应；TNF公司α，肿瘤坏死因子α。
图2
图2
miR-146a调节Jurkat T细胞与细胞因子刺激的hCMEC/D3细胞的粘附。用Pre-miR-146a或打乱的Pre-miR转染六通道载玻片中的hCMEC/D3细胞，不进行处理或用1 纳克/毫升TNFα和干扰素γ24小时。然后将hCMEC/D3细胞暴露于CMFDA标记的Jurkat细胞或原代人类T细胞中5分钟，浓度为0.5 达因/厘米2. (A类)定量分析Pre-miR-146a对Jurkat T细胞粘附的影响。(B类)定量分析抗miR-146a对Jurkat T细胞粘附的影响。(C类)定量分析Pre-miR-146a对原发性人类T细胞粘附的影响。数据表示平均值±标准误差。，n个=4，用于Jurkat T细胞粘附试验，n个=3对于初次人类T细胞粘附试验，每组在每种条件下进行了重复实验*P（P）<0.05, **P（P）<0.01***P（P）<0.001通过学生配对t吨-测试。干扰素γ,干扰素γ；miR，microRNA；TNF公司α,肿瘤坏死因子α。
图3
图3
hCMEC/D3细胞中的miR-146a负性调节核NF-κB易位。(A类)显微照片显示NF-κ未经处理或用1 纳克/毫升TNFα和干扰素γ持续0.5、6和24小时。比例尺，100 μ米(B类)Pre-miR-146a对核因子核转位的影响-κhCMEC/D3细胞中的B p65。注意miR-146a的异位表达抑制了NF的核转位-κB p65在所有三个时间点。细胞因子治疗后所有时间点的双向方差分析（ANOVA）测试表明，Scrambled组和Pre-miR-146a组之间存在显著差异(P（P）<0.001). 单因素方差分析用于比较两组在每个时间点的差异。数据表示平均值±标准误差。，n个=3, *P（P）<0.05, **P（P）<0.01。(C类)抗miR-146a对核因子核转位的影响-κhCMEC/D3细胞中的B p65。注意miR-146a的敲除增加了NF的核转位-κB p65在所有三个时间点。细胞因子治疗后所有时间点的双向方差分析表明，Scrambled组和Anti-miR-146a组之间存在显著差异(P（P）<0.001). 采用单因素方差分析比较两组在每个时间点的差异。数据表示平均值±标准误差。，n个=3, *P（P）<0.05. (天)将RelA小干扰（siRelA）或小干扰对照（siControl）转染12孔板中的hCMEC/D3细胞，48小时后，细胞未经处理或用1 纳克/毫升TNFα和干扰素γ0.5、6和24小时，对RelA进行western blot。注意，siRelA在所有三个时间点都抑制了未经治疗或细胞因子刺激细胞中RelA的表达。siRNA−，siControl；siRNA+，siRelA。(E类)RelA表达减少阻止Jurkat T细胞与细胞因子刺激的hCMEC/D3细胞粘附。数据表示平均值±标准误差。，n个=4, *P（P）<0.05, **P（P）<0.01通过学生配对t吨-测试。干扰素γ,干扰素γ；miR，microRNA；TNF公司α,肿瘤坏死因子α。
图4
图4
miR-146a靶向IRAK1和TRAF6以调节NF-κB活化和Jurkat T细胞粘附。(A类)Western blot分析表明，通过Pre-miR-146a转染miR-146a过度表达可抑制hCMEC/D3细胞中IRAK1和TRAF6的表达，无论是非刺激性的还是细胞因子（1 ng/mL肿瘤坏死因子α/干扰素γ)-刺激0.5、6和24小时。(B类,C类)通过ImageJ定量IRAK1和TRAF6的蛋白质水平。数据表示平均值±标准误差。，n个=3, *P（P）<0.05, **P（P）<0.01***P（P）<0.001通过方差分析（ANOVA）事后（post-hoc）比较和Bonferroni校正。(天)通过对IRAK1的小干扰RNA（siIRAK1）敲低IRAK1的表达降低了Jurkat T细胞对细胞因子刺激的hCMEC/D3细胞的粘附。(E类)通过siTRAF6敲低TRAF6的表达下调Jurkat T细胞与细胞因子刺激的hCMEC/D3细胞的粘附。(F类)抑制IRAK1和TRAF6的表达同时降低Jurkat T细胞与细胞因子刺激的hCMEC/D3细胞的粘附。数据表示平均值±标准误差。，n个=3到4*P（P）<0.05, **P（P）<0.05, ***P（P）通过方差分析<0.001。(G公司)siIRAK1和siTRAF6对NF核转位影响的统计分析-κB.细胞因子治疗后所有时间点的双向方差分析表明，siControl组与siIRAK1或siTRAF6或siIRAK1+siTRAF5组之间存在显著差异(P（P）<0.01). 使用单向方差分析比较各时间点与siControl的差异。数据表示平均值±标准误差。，n个=3, *P（P）<0.05, **P（P）<0.01。干扰素γ,干扰素γ；IRAK1、IL-1受体相关激酶1；miR，microRNA；TNF公司α,肿瘤坏死因子α；TRAF6，TNF受体相关因子6。
图5
图5
miR-146a靶向NFAT5和RhoA以调节NF-κB活化和Jurkat T细胞粘附。(A类)Western blot分析表明，通过Pre-miR-146a转染miR-146a过度表达可抑制未经治疗或经细胞因子治疗0.5、6和24小时的hCMEC/D3细胞中NFAT5和RhoA的表达。(B类,C类)通过ImageJ定量NFAT5和RhoA的蛋白质水平。数据表示平均值±s.e.m。，n个=3, *P（P）<0.05, **P（P）<0.01***P（P）<0.001通过方差分析（ANOVA）事后（post-hoc）比较和Bonferroni校正。(天)siNFAT5降低了Jurkat T细胞对细胞因子刺激的hCMEC/D3细胞的粘附。(E类)siRhoA下调Jurkat T细胞与细胞因子刺激的hCMEC/D3细胞的粘附。数据表示平均值±标准误差。，n个=3到4*P（P）<0.05, **P（P）<0.01***P（P）<0.001通过学生配对t吨-测试。(F类)siNFAT5和siRhoA对NF核转位影响的统计分析-κB.细胞因子治疗后所有时间点的双向方差分析表明，siControl组与siNFAT5或siRhoA组之间存在显著差异(P（P）<0.001). 使用单向方差分析比较各时间点与siControl的差异。数据表示平均值±标准误差。，n个=3, **P（P）<0.01***P（P）<0.001. (G公司)3'-UTR荧光素酶分析表明，miR-146a的过度表达导致用慢病毒荧光素素酶载体转导的hCMEC/D3细胞中荧光素酶活性降低，该载体含有RhoA或NFAT5的3'-UTR，但没有相应的突变3'-UTR版本。文本框显示了人类miR-146a（hsa-miR-146 a）和RhoA的3'-UTR中的两个靶位点以及NFAT5的3'-UTR中的一个靶位点的序列比对。RhoA或NFAT5的突变3'-UTR（mut-RoA，mut-NFAT5）通过用四个核苷酸取代相应的miR-146a靶位点来进行：AAGA。数据表示平均值±标准误差。，n个=3, *P（P）<0.05通过学生t吨-测试。miR，microRNA；3'-UTR，3'-未翻译区域。
图6
图6
miR-146a调控NF的表达-κB靶基因。(A类)用Pre-miR-146a或打乱的Pre-miR转染hCMEC/D3细胞，不进行处理或用1 纳克/毫升TNFα和干扰素γ24小时。两种NF的表达-κB靶基因VCAM1公司和CCL2级通过SYBR绿色定量RT-PCR进行分析，并归一化为β-肌动蛋白，表示为与扰民控制的相对水平。(B类)用Anti-miR-146a或搅乱的Anti-miR转染hCMEC/D3细胞，未经处理或用1 纳克/毫升TNFα和干扰素γ24小时。的表达式VCAM1公司和CCL2级通过SYBR绿色定量RT-PCR进行分析，并归一化为β-肌动蛋白，表示为与扰民控制的相对水平。(C类)将hCMEC/D3细胞用siIRAK1、siTRAF6或两者转染，或用扰乱的siControl转染，然后不处理或用1 纳克/毫升TNFα和干扰素γ24小时。的表达式VCAM1公司和CCL2级通过SYBR绿色定量RT-PCR进行分析，并归一化为β-肌动蛋白，表示为与siControl的相对水平。(天)hCMEC/D3细胞转染siRelA、siNFAT5或siRhoA或打乱的siControl，不处理或用1 ng/mL肿瘤坏死因子α和干扰素γ24小时。的表达式VCAM1公司和CCL2级通过SYBR绿色定量RT-PCR进行分析，并归一化为β-肌动蛋白，表示为与siControl的相对水平。(电子-仪表)Pre-miR-146a转染hCMEC/D3细胞中VCAM1蛋白水平的Western blot分析(E类)、siIRAK1或siTRAF6(F类)，siIRAK1和siTRAF6一起(G公司)、siRhoA或siNFAT5(H（H）)，siRelA(我)未经治疗或用1 纳克/毫升TNFα/INF（信息）γ24小时。数据表示平均值±标准误差。，n个=3, *P（P）<0.05, **P（P）<0.01***P（P）通过方差分析<0.001。干扰素γ,干扰素γ；miR，microRNA；逆转录聚合酶链反应；TNF公司α,肿瘤坏死因子α。
图7
图7
miR-146a抑制NF的机制-κB和T细胞粘附。促炎细胞因子TNFα和干扰素γ通过其在脑内皮细胞上的特定受体发挥作用，激活受体相关分子IRAK1和TRAF6，然后启动IKKβ-介导的I的磷酸化和泛素化κB、 导致NF活化和核转位-κB（p50/p65）。NF公司-κB启动包括CCL2和VCAM1在内的mRNA转录。CCL2作为T细胞的化学吸引剂，通过与VCAM1的相互作用吸引并粘附在脑内皮细胞上。NF公司-κB还启动包括初级miR-146a在内的负反馈调节剂。初级miR-146a由核RNase III酶Drosha加工成Pre-miR-146。Pre-miR-146a被转运到细胞质中，在那里它被细胞质RNase III酶Dicer进一步加工成成熟的miR-146a。NFAT5和RhoA均正向调节NF-κB活动。因此miR-146a抑制NF-κB通过抑制IRAK1、TRAF6、NFAT5和RhoA激活，导致CCL2和VCAM1表达降低，导致T细胞与脑内皮的粘附性降低。干扰素γ,干扰素γ；IRAK1、IL-1受体相关激酶1；miR，microRNA；TNF公司α,肿瘤坏死因子α；TRAF6，TNF受体相关因子6。
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