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.2014年11月；21(11):962-968.
doi:10.1038/nsmb.299。 Epub 2014年10月5日。

BRCA2乳腺癌抑癌基因的结构和作用机制

塔哈·沙希德 # 1, 乔安娜·索洛卡 # 2, 艾瑞克·孔 # 1, 劳伦特·马利弗特 2, 迈克尔·迈克尔·麦克莱思 2, 蒂尔曼·佩普 1, 斯蒂芬·C·韦斯特 2, 张晓东 1
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BRCA2乳腺癌抑癌基因的结构和作用机制

塔哈·沙希德等。 自然结构分子生物学. 2014年11月.

摘要

BRCA2突变增加了乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌的易感性。人类BRCA2的产物BRCA2蛋白在RAD51介导的同源重组修复DNA双链断裂和品牌间交联中起着关键作用。在这里，我们展示了全长（3418个氨基酸）BRCA2的生物化学和结构特征，单独或与RAD51复合。我们表明，BRCA2促进RAD51纤丝在单链DNA上的多个位点成核。三维EM重建显示，BRCA2以二聚体的形式存在，两组方向相反的RAD51分子与二聚体结合。单牌DNA沿着BRCA2的长轴结合，因此只有一组RAD51单体才能与DNA形成生产性复合物并形成细丝。我们的数据定义了这种肿瘤抑制剂促进RAD51介导的同源重组修复的分子机制。

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数字

图1
图1。BRCA2的三维重建和区域识别
(一)三维重建的曲面视图。两半被涂成黄色和青色，代表两种潜在的单体，尽管确切的边界尚不清楚。(b至g)针对C末端Flag标签的抗体标记(b-d（英国）)和BRC重复(电子-克). 在(b条)和(e（电子）)，圈出带有抗体的原始颗粒。(c（c）)和(（f）)沿相同方向的重投影(b）和(e）. (d日)和(克)沿与(b）和(e），抗体位置用球体表示。(小时)和(我)BRCA2的俯视图和侧视图，抗体位置为彩色（旗帜标签-蓝色，BRC-洋红）。所有单粒子图像中的放大条表示100Å。
图2
图2。BRCA2-RAD51复合体的三维重建
(一)和(b条)三维重建的侧视图和顶视图。(c（c）)针对RAD51的抗体标记。左图：抗体圈出的单个颗粒。中间：BRCA2-RAD51重建的相应重影。右：沿同一方向的表面视图，抗体位置用球体表示。(d日)圆柱体代表从单个粒子定义的抗体位置（上部）。它们在连接两半（下部橙色表面）的外缘上的密度区域相交。
图3
图3。RAD51绑定到BRCA2
(一)BRCA2二聚体（黄色和青色）和BRCA2-RAD51（粉色网格）的叠加突出了它们形状的差异。(b条)重新排列的BRCA2二聚体安装在BRCA2-RAD51复合物中。(c（c）)如中所示（b） ●●●●。四个RAD51单体（橙色丝带）被安装到BRCA2-RAD51的附加密度中，而BRCA2密度没有考虑到这一点。(d日)四个RAD51单体，排列成细丝状。（e）使用STEM测量BRCA2-RAD51复合物的质量直方图，显示800 kD和1200 kD处的峰值，对应于与8-10 RAD51结合的BRCA2二聚体和BRA2二聚体。
图4
图4。BRCA2和BRCA2-RAD51复合物的ssDNA结合
(一)凝胶位移法显示BRCA2与5′的结合-32P标记的ssDNA底物范围为20至100 nt。DNA通过放射自显影术检测。(b条)BRCA2与缺口DNA结合的单个粒子图像（双臂用橙色表示）。放大倍数条代表100°。(c-e公司)如图所示，RAD51-ssDNA细丝、BRCA2-ssDNA复合物和BRCA2-RAD51-ssDNA复合物的电子显微镜显示。(（f）)免疫金标记BRCA2在BRCA2-RAD51-ssDNA复合物中的定位。(克)用5′-金粒子标记ssDNA形成的BRCA2-RAD51细丝的可视化。放大条表示100 nm。
图5
图5。BRCA2对RAD51纤维的成核作用
(一)和(b条)通过电子显微镜测定BRCA2对RAD51-ssDNA成核事件数量的影响。插入显示RAD51灯丝的放大。(c-d公司)RAD51-ssDNA纤维长度的量化(c（c）)和成核事件(d日)根据图4c（n=314）和图4所示图像的测量结果，在BRCA2存在（蓝色）或不存在（橙色）的情况下e（电子）（n=332），n=RAD51灯丝数量。总共对204（RAD51-ssDNA）和149（BRCA2-RAD51-ssDNA）随机收集的网格区域进行了量化。P值（P＜0.0001）采用双尾t检验确定，误差条代表SD(e（电子）)BRCA2-RAD51-ssDNA复合物可视为同一ssDNA分子上的多个不同的丝状成核位点（箭头所示）。放大条表示100 nm。
图6
图6。BRCA2在RAD51灯丝成核中的作用模式
(一)RPA的晶体结构与30 nt ssDNA结合，显示出紧密的结构，并将ssDNA弯曲成U形。BRCA2的DNA结合域可以适应相似的构象。显示ssDNA的极性。两个RPA分子通过2倍对称性相关，可以代表BRCA2二聚体中的DNA结合域，如下所示。(b条)BRCA2的DNA结合域（1，2，3，4）与（a）中RPA的构象类似，因此ssDNA可以同时结合到一个BRCA2单体的5′端（左侧）的域3-4（OB2-OB3），而第二个单体的3′端（右侧）的域1-2（alpha-helical域和OB1）。两组RAD51分子以相反方向结合BRCA2二聚体。ssDNA结合只能产生一组。(c（c）)使用多个BRCA2-RAD51成核位点的灯丝形成和伸长模型，BRCA2作为RAD51的分子伴侣。
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