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.2014年6月；55(6):417-25.
doi:10.4111/kju.2014.55.6417。 Epub 2014年6月16日。

前列腺上皮RWPE-1细胞高效天然免疫应答需要β-防御素124

金京华 1, Jaehyuk Lee先生 1, 韩俊贤 2, Soon Chul Myung先生 三
附属公司

β-防御素124是前列腺上皮RWPE-1细胞中高效天然免疫应答所必需的

金庆华等。 朝鲜语J Urol. 2014年6月.

摘要

目的：本研究旨在确定β-防御素124（DEFB124）在细菌感染期间前列腺上皮RWPE-1细胞天然免疫中的作用。

材料和方法：通过定量实时聚合酶链反应（PCR）、Western blotting和免疫细胞化学检测DEFB124的表达。采用酶联免疫吸附试验和实时定量PCR检测细胞因子和趋化因子的产生。采用Western blotting和染色质免疫沉淀研究评估肽聚糖（PGN）刺激的RWPE-1细胞中DEFB124和核因子κB（NF-κB）之间的相互作用。通过趋化性试验，我们评估了DEFB124对单核细胞迁移的影响。

结果：暴露于PGN可通过IκBα磷酸化和IκBα降解诱导DEFB124上调和NF-κB活化。NF-κB抑制剂Bay11-7082阻断了PGN诱导的DEFB124生成。此外，在经PGN处理的人前列腺上皮RWPE-1细胞中，NF-κB被证明是一种直接调节因子，并直接结合到DEFB124启动子的-3.14 kb位点。有趣的是，当DEFB124在RWPE-1细胞中过度表达时，细胞因子（白细胞介素[IL]6和IL-12）和趋化因子（CCL5、CCL22和CXCL8）的产生显著增加。这些DEFB124上调了RWPE-1细胞对THP-1单核细胞的趋化活性。

结论：综上所述，这些结果首次提供了强有力的证据，证明通过NF-κB激活增加PGN暴露的RWPE-1细胞中DEFB124的表达，可以增强细胞因子和趋化因子的产生，这可能有助于有效的先天免疫防御。

关键词：趋化性；细胞因子/趋化因子；防御素；先天免疫；NFκB。

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利益冲突声明

作者没有什么要透露的。

数字

图1
图1
肽聚糖（PGN）通过核因子κB（NF-κB）激活诱导RWPE-1细胞中β-防御素124（DEFB124）的基因表达。（A） PGN诱导DEFB124 mRNA表达。用PGN（10µg/mL）处理RWPE-1细胞指定的时间，并通过逆转录聚合酶链反应测定DEFB124的表达。（B） PGN导致RWPE-1细胞NF-κB活化。用10µg/mL PGN刺激细胞，并在指定的时间点提取蛋白质。western blot检测IκBα的磷酸化和泛素化。ACTB被用作内部控制。（C） NF-κB的激活是PGN诱导的DEFB124上调所必需的。用PGN或NF-κB抑制剂Bay11-7082（10µM）处理RWPE-1细胞，并用酶联免疫吸附法测定培养上清液中分泌的DEFB124蛋白的浓度。浓度是每毫升蛋白质的微克数，数据是三个不同实验的平均结果。不同字母表示p<0.0001时存在显著差异。（D） PGN通过NF-κB活化诱导DEFB124的产生。用PGN或Bay11-7082处理RWPE-1细胞，并用免疫细胞化学方法评估PGN诱导的DEFB124蛋白的减少。RWPE-1细胞在4%多聚甲醛中固定，用抗DEFB124抗体（绿色）染色，PI（红色）复染DNA染色。（E） NF-κB与DEFB124染色质结构相互作用。在PGN刺激的RWPE-1细胞中，NF-κB直接结合在DEFB124-3.14 Kb位点。结果是三个独立实验的平均值，输入DNA的归一化结果表示为免疫沉淀PGN处理的RWPE-1细胞与未处理的对照RWPE-1细胞相比的相对富集。星号表示与一致NF-κB结合序列（CBS）的位点差异。哥伦比亚广播公司，GGGRNNYYCC；R、 嘌呤；Y、 嘧啶。不同字母表示p<0.0001时存在显著差异。
图2
图2
RWPE-1细胞中β-防御素124（DEFB124）的过度表达。（A） DEFB124 mRNA过度表达。用DEFB124-DDK-Myc载体或空载体转染RWPE-1细胞，通过逆转录聚合酶链反应（左）和定量实时聚合酶链式反应（右）检测DEFB124 mRNA的表达。ACTB被用作内部控制。星号表示p<0.0001时的统计显著性。（B） DEFB124蛋白上调。用抗DEFB124和Myc抗体进行western blot检测。ACTB被用作内部控制。
图3
图3
β-防御素124（DEFB124）上调诱导细胞因子和趋化因子的产生增加。DEFB124促进DEFB124-诱导的RWPE-1细胞中细胞因子（A）和趋化因子（B）的mRNA表达。用定量实时聚合酶链反应测定这些基因的mRNA表达。根据周期阈值计算每个基因的相对表达水平，并使用ACTB进行标准化，并根据空载体转染的RWPE-1细胞中每个基因的表达计算表达比率。实验重复至少三次，数据表示为平均值±标准误差（SEM）。星号，*和**，分别在p<0.05和p<0.01时具有统计学意义。（C） DEFB124是细胞因子和趋化因子产生所必需的。收集空载体或DEFB124-DDK-Myc转染的RWPE-1细胞的上清液。用多分析物酶联免疫吸附试验（ELISA）测定上清液中细胞因子和趋化因子的浓度。该图显示了三倍的平均ELISA吸光度值（450 nm），误差条代表SEM。星号(*, **、和***)分别表示p<0.02、p<0.005和p<0.0001时的统计显著性。白介素，白介素。
图4
图4
β-防御素124（DEFB124）介导的细胞因子和趋化因子上调促进THP-1单核细胞的趋化反应。DEFB124或DEFB124-介导的细胞因子和趋化因子诱导THP-1单核细胞的趋化性。THP-1细胞（1×106细胞）添加到上腔，下腔含有来自空载体或DEFB124-DDK-Myc转染的RWPE-1细胞的上清液。结果显示为一个迁移指数，表示细胞在空载体上迁移的倍数增加。单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）（100 ng/mL）用作阳性对照。结果代表了三个独立的实验。星号表示p<0.02时的统计显著性。
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