Regulation of the VHL/HIF-1 pathway by DJ-1

doi:10.1523/JNEUROSCI.1244-13.2014

.2014年6月4日；34(23):8043-50.

doi:10.1523/JNEUROSCI.1244-13.2014。

DJ-1对VHL/HIF-1途径的调节

附属公司

¹细胞和分子医学系。
²加拿大安大略省金斯顿市皇后大学眼科细胞和分子医学系K7L 5G2。
^三坎贝尔乳腺癌研究家庭研究所，加拿大安大略省多伦多市M5G 2C1，和。
⁴加拿大安大略省渥太华市渥太华大学系统生物学研究所K1H 8M5。
⁵韩国釜山609-735釜山国立大学干扰素机电工程系细胞和分子医学系dpark@uottawa.ca。

PMID： 24899725
预防性维修识别码： PMC6608259型
内政部： 10.1523/JNEUROSCI.1244-13.2014

DJ-1对VHL/HIF-1途径的调节

穆罕默德·帕萨内贾德等。神经科学. 2014.

.2014年6月4日；34(23):8043-50.

doi:10.1523/JNEUROSCI.1244-13.2014。

附属公司

¹细胞和分子医学系。
²加拿大安大略省金斯顿市皇后大学眼科细胞和分子医学系K7L 5G2。
^三坎贝尔乳腺癌研究家庭研究所，加拿大安大略省多伦多市M5G 2C1，和。
⁴加拿大安大略省渥太华市渥太华大学系统生物学研究所K1H 8M5。
⁵韩国釜山609-735釜山国立大学干扰素机电工程系细胞和分子医学系dpark@uottawa.ca。

PMID： 24899725
预防性维修识别码： PMC6608259型
内政部： 10.1523/JNEUROSCI.1244-13.2014

摘要

DJ-1（PARK7）是一个与常染色体隐性帕金森病（PD）相关的基因。我们之前的研究表明，在PD和中风模型中，DJ-1缺失会使神经元敏化。然而，这种保护作用的生化机制尚不完全清楚。在这里，我们将Von Hippel Lindau（VHL）蛋白确定为关键的DJ-1相互作用蛋白。我们提供证据表明，DJ-1通过抑制HIF-VHL相互作用，负调控缺氧诱导因子-1（HIF-1α）α亚基的VHL泛素化活性。与该观察结果一致，DJ-1缺乏导致缺氧和氧化应激模型中HIF-1α水平降低，这两种应激可稳定HIF-1β。我们还证明，HIF-1α的积累可以拯救DJ-1缺陷神经元对抗1-甲基-4-苯基吡啶诱导的毒性。有趣的是，与正常人相比，从DJ-1-相关PD患者中提取的淋巴母细胞显示出HIF-1α稳定性受损，这表明DJ-1-VHL连接也可能与人类环境有关。总之，我们的发现揭示了DJ-1通过调节VHL-HIF-1α途径介导神经元存活的模型。

关键词：DJ-1；帕金森病；氧化应激。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
DJ-1与VHL交互。A类对SH-SY5Y细胞进行裂解，用VHL抗体免疫沉淀内源性VHL，并用DJ-1抗体进行Western blot分析。B类表达FLAG-VHL-GFP（F-VHL-G）的SH-SY5Y细胞经25μ米H（H）₂O（运行）₂，然后裂解。用FLAG抗体免疫沉淀FLAG-VHL-GFP，并用DJ-1抗体进行SDS-PAGE分析。F、 FLAG抗体；一、 IgG控制。

**图2。**
DJ-1和VHL之间的功能链接。A类,B类、WT或*DJ-1型*KO皮层神经元(A类)或MEF(B类)在正常条件下或在缺氧（1%氧气）中孵育180分钟（神经元）或40分钟（MEFs）。C类，用15μ米H（H）₂O（运行）₂持续2小时。D类、重量和*DJ-1型*KO MEF也暴露于0或25μ米H（H）₂O（运行）₂对细胞进行24 h的裂解，并使用HIF-1α抗体通过Western blot评估HIF-1β蛋白水平。每个实验的HIF-1α蛋白密度测定分析显示在每个面板的右侧。数据是来自三个独立实验的平均值±SEM*第页< 0.05; **第页<0.01，用Tukey的后验进行方差分析。E类，从两例PD患者中提取的淋巴母细胞，其中一例在*DJ-1型*（Del）和一个在*DJ-1型*（L166P）或对照（Ctr）个体暴露于50μ米用HIF-1α抗体进行Western blot分析，检测24 h过氧化氢及其对HIF-1β的反应。

**图3。**
HIF-1α表达在*DJ-1型*WT和KO神经元及其反应依赖于VHL。A类,B类、WT或*DJ-1型*KO皮层神经元暴露于缺氧40和180分钟(A类)或不同浓度的H₂O（运行）₂（0、5、10和15μ米)持续2小时(B类).HIF-1型α转录物通过RT-PCR扩增。每个实验的密度分析在中间和右侧面板中进行了演示。C类,*HIF-1型*WT或*DJ-1型*暴露于氧化应激的KO皮层神经元（左、0和15μ米2 h）和缺氧（右侧、0和180 min）也使用qRT-PCR进行分析。D类、重量和*DJ-1型*KO皮层神经元接受15μ米H（H）₂O（运行）₂持续2小时或1米米使用HIF-1α抗体通过Western blot评估DMOG 3 h的HIF-1β水平。密度测定分析如右图所示。每个条形图是三个独立实验的平均值±SEM*第页< 0.05; **第页< 0.01; ***第页<0.001方差分析。

**图4。**
HIF-1α泛素化受DJ-1调节，HIF-1过度表达可保护神经元抵抗MPP⁺.A类,B类,体外通过将GST-HIF-1α蛋白与其泛素化途径的组分（包括hUBA1、hUBC5A和VHL复合物）在30°C下孵育2小时，在有或无DJ-1蛋白的情况下进行VHL泛素化检测。使用不含VHL或泛素的组作为对照。反应后，用谷胱甘肽Sepharose珠从检测混合物中沉淀GST-HIF-1α（G-HIF-1），并用泛素和VHL抗体分别通过Western blot分析评估其泛素化水平和与VHL相互作用的能力。在开始泛素化之前，每个反应中VHL和GST-HIF-1α的总含量显示为输入。泛素化和VHL–HIF-1α相互作用的密度分析显示在中间和右侧面板中。C类,D类,体内通过稳定泛素化HIF-1α（Ubq-HIF-1α）在WT或*DJ-1型*用MG-132（20μ米1h），暴露于缺氧（1h）。用HIF-1α抗体通过Western blot分析评估HIF-1β水平。通过将每个基因型的低氧+MG-132的Ubq-HIF-1α信号密度归一化为相同基因型的MG-132，然后再归一化到MG-132-plus低氧组的WT信号密度，对Ubq-HIF-1α进行定量。E类,F类，初级皮层神经元来源于*DJ-1型*KO或WT小鼠胚胎用DMOG预处理2 h，然后用MPP处理⁺(20 μ米)48小时。神经元为(E类)裂解并计数完整的细胞核(n个=4）或(F类)通过MTT生存分析评估(n个= 3).G公司GFP-SHIF-1α和表达GFP的腺病毒在WT和DJ-1KO皮层神经元中过度表达稳定型HIF-1α（GFP-SHIF-1α）或GFP单独作为对照。然后将细胞暴露于20μ米MPP公司⁺48小时后，用Hoechst染色固定细胞核。***H（H）***，通过计算具有完整细胞核和GFP信号（a和b）的神经元与GFP表达细胞总数的比率来检测它们的生存能力(n个= 3).H（H）培养皮层神经元中GFP-SHIF-1α的腺病毒表达(哈和***Hc公司***)和Hoechst染色检测完整细胞核和凋亡细胞核(***血红蛋白***和***血红蛋白***).H（H）右，使用HIF-1α抗体，通过Western blot检测感染GFP-SHIF-1α表达腺病毒的RCC细胞中的GFP-SHIF-1α。每个条形图是三个或四个独立实验的平均值±SEM*第页< 0.05; **第页< 0.01; ***第页<0.001 ANOVA检验和Tukey的后验。

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[10] Bonifati V、Rizzu P、van Baren MJ、Schaap O、Breedveld GJ、Krieger E、Dekker MC、Squitieri F、Ibanez P、Joosse M、van Dongen JW、Vanacore N、van Swieten JC、Brice A、Meco G、van Duijn CM、Oostra BA、Heutink P。与常染色体隐性遗传早发性帕金森综合征相关的DJ-1基因突变。科学。2003;299:256–259. doi:10.1126/science.1077209。-内政部-公共医学

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