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.2014年6月27日;289(26):18258-69.
doi:10.1074/jbc。M114.547208。 Epub 2014年5月13日。

ARF合作者(CARF)通过DNA损伤信号的剂量依赖性调节调节人类细胞的增殖命运

附属公司

ARF合作者(CARF)通过DNA损伤信号的剂量依赖性调节调节人类细胞的增殖命运

卡罗琳·T·张等。 生物化学杂志. .

摘要

ARF(CARF)的合作者已被证明直接结合并调节p53,p53是一种通过细胞衰老和凋亡控制肿瘤抑制的中心蛋白。然而,CARF的细胞功能及其对衰老、凋亡或增殖的影响机制尚不清楚。我们以前的研究表明:(i)CARF在复制和应激诱导的衰老过程中上调,其外源性过度表达导致细胞衰老样生长停滞,(ii)CARF的抑制诱导非整倍体、DNA损伤和有丝分裂突变,通过ATR/CHK1途径导致细胞凋亡。在本研究中,我们通过研究CARF在体外和体内过度表达所触发的分子途径,剖析了CARF的细胞作用。我们发现CARF的剂量是决定癌细胞增殖潜力的关键因素。最令人惊讶的是,尽管适度的CARF过度表达会导致衰老,但极高水平的CARF会导致细胞增殖增加。我们证明,CARF水平通过ATM/CHK1/CHK2、p53和ERK通路对细胞的DNA损伤和检查点反应至关重要,而这些通路又决定了癌细胞向生长停滞或增殖和恶性表型的增殖命运。据我们所知,这是第一份证明基本蛋白CARF在两个相反方向上控制细胞增殖的能力的报告,因此可能在肿瘤生物学和癌症治疗学中发挥关键作用。

关键词:CARF;细胞增殖;细胞调节;细胞衰老;DNA损伤反应;恶性;第53页。

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数字

图1。
图1。
CARF的剂量依赖性表达对细胞生长有相反的影响。 A类Western blotting检测到HeLa细胞中不同数量的GFP标记和内源性CARF水平。肌动蛋白被用作负荷控制,实验至少进行了三次。B类HeLa细胞的对照、COE和CSE衍生物的形态差异。C类CSE中细胞增殖增加(蓝线)COE中细胞生长速度较低(绿线)与对照组相比(红线)单元格。D类克隆形成存活试验显示,与对照细胞相比,CSE中的克隆数更多,COE细胞中的克隆数量更少。数据以菌落平均数表示(至少来自三个实验)±S.D.*,第页< 0.05.E类F类,增长率(E类)对照组、GOE和GSE细胞的存活率(F)。G公司,衰老相关的HP1γ(红色)染色显示COE细胞异染色质病灶定位。H(H)划痕后0、18和36小时进行伤口愈合试验。,通过Wimasis WimCratch软件定量分析图像。J实时运动试验显示,与对照细胞相比,CSE细胞增加,COE细胞减少。K(K)将对照组和CSE HeLa细胞皮下注射到裸鼠体内(n个=6/组)。两周后,只有CSE小鼠出现了大肿瘤。小鼠和实验性肿瘤的详细情况如下图所示。反对的论点,控制。
图2。
图2。
COE中p53和DDR以及CSE细胞中MMPs的优先激活。 A类,代表性印迹显示GFP标记的CARF、p53和p21的表达WAF1(加权平均1)在U2OS细胞中,分别表明COE和CSE细胞中p53通路的增加和减少。U2OS和HeLa细胞中至少三个实验的条带密度定量显示为p53和p21WAF1(加权平均1)表达水平随着折叠次数的变化而变化(设置为1),数据显示为平均值±标准偏差。B类、带有GFP标记CARF的HeLa细胞(绿色信号灯)用抗p53免疫染色(红色)抗体。仅在COE细胞中观察到p53的核蓄积增加(箭头). pATM和γH2AX免疫染色显示病灶形成(中间面板,箭头)在COE中,但不是CSE细胞(右侧面板).C类免疫染色显示p53在对照组、GOE和GSE U20S细胞中表达。D类CSE细胞中MMPs表达增加,但COE细胞中没有。来自三个实验的条带的密度定量,其中MMP表达显示为相对于对照的折叠变化。E类Western blot分析显示ATM(1981年丝氨酸磷酸化,pATM)及其下游效应器、COE细胞中磷酸化CHK1(pCHK1)、磷酸化CHK2(pCHK2)和BRCA1的激活。CSE细胞pCHK1表达下调,pCHK2和BRCA1表达上调。F类,显示了三个独立实验的信号量化。G公司H(H)p53、p21的RT-PCR分析WAF1(加权平均1)、ATM、CHK1和CHK2显示p53和p21增加WAF1(加权平均1)COE细胞中的转录物。ATM和CHK1转录物水平在COE和CSE细胞中保持不变。CSE细胞中CHK2转录物增加。肌动蛋白和GAPDH分别用作免疫印迹和RT-PCR的负荷对照。所有实验都至少进行了三次。密度定量来自至少三个实验。*,第页< 0.05; **,第页<0.01。反对的论点,控制。
图3。
图3。
ATM参与CARF过度表达诱导的生长停滞。 A类在中度CARF过度表达的ATM-null AT5-BIVA和FTV细胞系中,衰老表型发生逆转,而CSE细胞的生长未受影响,正如集落形成分析所评估的那样。B类C类,ATM缺陷COE和CSE细胞中的菌落数显示为相对于对照的折叠变化,设置为1。结果来自三个独立的实验,显示为平均值±标准偏差。反对的论点,控制。
图4。
图4。
CHK1参与COE细胞的生长阻滞,而促进CSE细胞的增殖。 A类siRNA敲除CHK1可恢复COE细胞的生长停滞(与对照siRNA细胞相比,CHK1 siRNA处理细胞的变化为2.48±0.08倍;第页= 0.0002).B类集落形成实验显示CHK1沉默在COE细胞中产生的集落数多于对照siRNA处理。C类CHK1-受损COE细胞增殖增加,显示p53及其下游调节因子p21减少WAF1(加权平均1),而ATM保持不变。D类E类,CHK1过度表达的CSE细胞中细胞生长减少,如克隆形成所示(D类)和MTT分析(E类)(CHK1-CSE与对照GFP细胞相比变化0.78±0.04倍;第页= 0.0006).F类CHK1过度表达CSE细胞,增殖减少,p53和p21相应增加WAF1(加权平均1)细胞活力图显示为车辆转染COE或CSE细胞的折叠变化,设置为1,数据显示为平均值±标准偏差。肌动蛋白被用作免疫印迹的负荷控制,每个实验至少进行三次。*,平均菌落数±来自三个独立实验的S.D。反对的论点,控制。
图5。
图5。
CHK2参与COE细胞的细胞生长阻滞。 A类,siRNA介导的COE和CSE细胞中的CHK2抑制导致两种细胞类型的细胞活力显著增加(MTT测定;第页< 0.0001,第页= 0.01; 分别)。这些图显示为车辆转染COE或CSE细胞的折叠变化,设置为1。数据显示为平均值±标准偏差。B类CHK2-silenced COE和CSE细胞的集落形成分析显示,与对照siRNA-处理的细胞相比,菌落数量更多。C类CHK2损害COE和CSE细胞的Western blotting显示CHK2减少,p53和p21相应减少WAF1(加权平均1)仅在COE单元中。而CSE细胞在敲低后显示出更高水平的CHK2,p53和p21WAF1(加权平均1)与对照细胞相比,水平也略有增加。D类克隆形成试验显示CHK2过度表达的CSE细胞增殖减少。包括三个独立实验的定量。E类CHK2-过度表达的CSE细胞增殖率较低,p53和p21表达增加WAF1(加权平均1).F类,来自三个独立实验的定量。肌动蛋白被用作免疫印迹的负荷控制。每个实验至少进行三次。*,菌落数±来自三个独立实验的S.D。反对的论点,控制。
图6。
图6。
ERK参与CARF介导的CSE细胞增殖上调。 A类CSE细胞中ERK磷酸化水平升高,而COE细胞中则降低。B类C类MTT法评估,当HeLa细胞被ERK抑制剂U0126处理时,CSE细胞(B)的增殖降低(第页=0.02),对应于p53和p21的增加WAF1(加权平均1)通过Western blot(C类).D类CHK1或CHK2受损的COE细胞和CHK2损伤的CSE细胞中磷酸化ERK增加(与各自的对照组相比,所有这些细胞都显示出更高的增殖)。E类F类在平行实验中,COE细胞中ERK1过度表达导致细胞生长增强(E类)如克隆形成试验所示,p53和p21的减少证实了这一点WAF1(加权平均1)(F类). 该图显示为车辆处理的CSE细胞的折叠变化,设置为1,数据显示为平均值±标准偏差。肌动蛋白被用作免疫印迹的负荷控制。每个实验至少进行三次。显示了三个独立实验的菌落平均数±S.D。反对的论点,控制。
图7。
图7。
CARF与CHK2和ERK1结合并相互作用。 A类,示意图显示了CARF过度表达诱导的生长停滞和超表达诱导的增殖表型所涉及的途径,如图1-6所示。CARF过度表达通过上调pATM、pCHK1/CHK2、p53和p21诱导DNA损伤并激活DDRWAF1(加权平均1)(由显示灰色方框向上箭头). 另一方面,CARF的超表达通过上调CHK2和ERKs抑制DDR(如图所示黑匣子向上箭头). CHK2的增加将平衡转移到非磷酸化形式,导致p53和p21WAF1(加权平均1)减少(显示为白色方框向下箭头)导致细胞增殖增加。ERK的增加导致p53和p21的下调WAF1(加权平均1)以及参与有丝分裂信号传导的ERK靶点的上调。B类,免疫沉淀(IP(IP))抗CARF抗体检测显示CARF对CHK2和ERK1的下拉作用。数据表明CARF直接与这些蛋白质结合。C类,HeLa细胞在阿霉素存在下培养48小时至2周。免疫印迹显示CARF、p53和p21增加WAF1(加权平均1)在48小时阿霉素存在下生长停滞的细胞中,细胞在长期(2周)阿霉素治疗下逃避生长停滞,CARF水平进一步升高,但p53和p21降低WAF1(加权平均1)蛋白质。肌动蛋白被用作免疫印迹的负荷控制。实验至少进行了三次。

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