Characterization of nuclear localization and SUMOylation of the ATBF1 transcription factor in epithelial cells

doi:10.1371/journal.pone.0092746

.2014年3月20日；9（3）：e92746。

doi:10.1371/journal.pone.0092746。 2014年电子收集。

ATBF1转录因子在上皮细胞中的核定位和SUMO化特征

孙晓东¹, 李杰（音译）¹, 弗雷德里克·N·东¹, 金堂洞¹

附属公司

PMID： 24651376
预防性维修识别码：项目经理3961433
内政部： 10.1371/日记.pone.0092746

上皮细胞ATBF1转录因子的核定位和SUMO化特征

孙晓东等。公共科学图书馆一号. 2014.

.2014年3月20日；9（3）：e92746。

doi:10.1371/journal.pone.0092746。 2014年电子收集。

作者

孙晓东¹, 李杰（音译）¹, 弗雷德里克·N·东¹, 金堂洞¹

附属

¹美国佐治亚州亚特兰大埃默里大学医学院血液学和医学肿瘤学系Winship癌症研究所。

PMID： 24651376
预防性维修识别码：项目经理3961433
内政部： 10.1371/journal.pone.0092746

摘要

ATBF1/ZFHX3是一种大转录因子，在发育、肿瘤发生和其他生物过程中发挥作用。ATBF1通常定位于细胞核，但在癌细胞的细胞质中经常定位错误。ATBF1定位错误的机制尚不清楚。在这项研究中，我们分析了ATBF1的核定位，发现外源性表达的ATBF1在细胞核中形成了类似核体（NB）的圆点，其中一些确实与早幼粒细胞白血病（PML）NB有物理联系。我们还定义了一个3-氨基酸基序KRK2615-2617作为ATBF1的核定位信号（NLS）。有趣的是，弥散分布的核SUMO1蛋白被隔离到ATBF1点中，这可能与ATBF1与PML NBs（已知SUMO化热点）的物理关联有关。此外，ATBF1本身是SUMOylated。ATBF1 SUMO化发生在3个以上的赖氨酸残基上，包括K2349、K2806和K3258，并且具有核特异性。最后，与ATBF1直接相互作用的PIAS3 SUMO1 E3连接酶减少而不是增强ATBF1 SUMO化，阻止ATBF1与SUMO1在细胞核中的共定位。这些发现表明，核定位和SUMO化对ATBF1的转录因子功能很重要，并且ATBF1可以与PML-NBs合作，在不同的生物过程中调节蛋白SUMO酸化。

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利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

**图1。核内类核体（NB）ATBF1点的检测和ATBF1核定位信号（NLS）的定义。**
A、如免疫荧光显微镜在表达EGFP-fused ATBF1（A）或HA-taged ATBF（B）的22Rv1细胞中检测到的，B.ATBF1在细胞核内聚集形成NB样小点。C.通过缺失映射、突变和免疫荧光显微镜鉴定ATBF1的NLS。左侧的每个框表示ATBF1片段或全长ATBF1（野生型或突变型，如*所示），并附有EGFP或HA标签。每个碎片盒与全长ATBF1对齐，以指示其在ATBF1中的相对位置。右侧图像显示片段或全长ATBF1的亚细胞定位，DAPI染色显示细胞核。残留物数量基于ATBF1-A蛋白质序列（NCBI访问号NP_008816）。

**图2。免疫荧光显微镜在22Rv1细胞中检测到ATBF1与PML核体（PML-NB）和细胞核中SUMO1的关联。**
A、 B.ATBF1点与Cajal体（A）无关，但与PML NB子集部分重叠（箭头）（B）。EGFP（绿色）显示ATBF1点，Cajal小体和PML NB分别通过抗Coilin或抗PML抗体显示（红色）。C.ATBF1和SUMO1的共调校。ATBF1点由抗HA抗体（红色）检测，野生型和突变型SUMO1蛋白由EGFP（绿色）检测。虽然野生型SUMO1与ATBF1点共定位，但突变形式（EGFP-SUMO1-GA）并非如此。细胞核通过DAPI复染显示。

**图3。用IB（A）和免疫沉淀结合IB（B）检测ATBF1 SUMO化。**
A.天然ATBF1和SUMOylated ATBF1均由抗ATBF1抗体检测。用抗GFP抗体检测SUMO1。B.ATBF1被抗-HA微球拉下，洗脱的蛋白被抗SUMO1或抗ATBF1抗体印迹。上部面板（最右侧车道）中的微弱带表明ATBF1被内源性SUMO1 SUMO化。A和B中的箭头表示移位的ATBF1频带，代表SUMOylated ATBF1。天然ATBF1蛋白约为400kD。用于转染的质粒列在顶部，包括HA标记的ATBF1（HA-ATBF1）和反义ATBF1。

**图4。ATBF1 SUMO酰化位点的鉴定。**
A.10个ATBF1片段（F1-F10）相对于全长ATBF1蛋白（顶部）的位置*在体外*SUMO酸化分析。在全长ATBF1的示意图中，根据Miura等人之前的预测，显示了潜在的功能域，包括锌指（椭圆）和同源结构域（矩形）。B.检测氨酰化ATBF1片段*在体外*对于每个片段，SUMO1在反应中存在（+）或缺失（-）。箭头指向SUMOylated ATBF1碎片。C.在3个ATBF1片段中被SUMO化的赖氨酸残基的鉴定。体外对具有不同赖氨酸突变体的ATBF1片段进行SUMO酸化分析。箭头表示3个片段的K2349R、K2806R和K3258R突变中SUMOylated ATBF1肽消失。

**图5。核定位对ATBF1进行SUMO化至关重要。**
A.NLS在KRK残基处的突变^2615–2617对ATBF1片段8的SUMO化没有影响*在体外*如IB.B检测到的，核定位失败会阻止ATBF1的SUMO化。将HA标记的野生型ATBF1（HA-ATBF1）或NLS缺陷的突变体（HA-ATBF1-NLSm）与GFP标记的SUMO1共转染到22Rv1细胞中，并用抗HA珠拉下细胞裂解物，并用抗GFP（上）或抗ATBF1抗体（下）印迹以检测SUMO化的ATBF1。天然ATBF1蛋白约为400kD。

**图6。PIAS3中断ATBF1 SUMO化。**
A.PIAS3降低了IB检测到的ATBF1 SUMO化。用于转染的质粒列在顶部。分别用抗ATBF1、抗FLAG和抗GFP抗体检测ATBF1，PIAS3和SUMO1。箭头指示SUMOylated ATBF1。天然ATBF1蛋白约为400kD。B.通过免疫共沉淀和IB证实PIAS3介导的ATBF1 SUMO化减少。ATBF1被抗-HA珠打倒，洗脱的蛋白质依次用抗ATBF1和抗SUMO1抗体印迹。箭头表示SUMO相关ATBF1的条带。C.PIAS3的表达阻止SUMO1与ATBF1的共定位。免疫荧光染色检测PIAS3（抗FLAG抗体，白色）、SUMO1（EGFP，绿色）和ATBF1（抗HA抗体，红色）。任何两个分子之间或所有三个分子之间（A1/S1/P3）的合并图像显示在下部面板上。细胞核用DAPI复染。

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