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.2013年12月4日;33(49):19276-83.
doi:10.1523/JNEUROSCI.3487-13.2013。

内吞受体LRP1对淀粉样蛋白-β的神经清除

附属公司

内吞受体LRP1对淀粉样蛋白-β的神经清除

Takahisa Kanekiyo先生等。 神经科学. .

摘要

阿尔茨海默病(AD)是老年人中最常见的痴呆形式。通过淀粉样前体蛋白(APP)的蛋白水解裂解产生的淀粉样-β(Aβ)肽的积累、聚集和沉积可能是AD发病机制中的始发事件。虽然家族性AD中Aβ的生成加快,但越来越多的证据表明,Aβ的清除受损是迟发性AD的原因。由于Aβ主要由神经元产生,因此在大脑中所有类型的细胞中,这些细胞遭遇Aβ的风险最高。然而,尚不清楚它们是否也参与Aβ清除。在这里,我们表明低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)在神经元中的受体介导的内吞作用在大脑aβ清除中起着关键作用。LRP1是包括Aβ在内的多种配体的内吞受体。小鼠前脑神经元中Lrp1的条件性敲除导致大脑Aβ水平升高,并选择性加剧淀粉样蛋白模型APP/PS1小鼠皮层中淀粉样斑块的沉积,而不影响Aβ的产生。体内微透析研究表明,神经元Lrp1基因敲除小鼠脑间质液中的Aβ清除率受损。由于神经元LRP1缺失并不影响主要Aβ降解酶、内普利素和胰岛素降解酶的mRNA水平,因此Aβ清除率的紊乱可能是由于LRP1介导的神经元Aβ摄取和降解受到抑制。总之,我们的结果表明LRP1在受体介导的Aβ清除中起着重要作用,并表明神经元不仅产生而且清除Aβ。

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数字

图1。
图1。
LRP1介导神经细胞对Aβ的摄取和降解。一个用LRP1-siRNA转染NT2细胞,转染48 h后用于分析。蛋白质印迹显示LRP1的表达受到LRP1 siRNA的抑制)孵育24小时后,用ELISA分析对照组和LRP1抑制的NT2细胞。B类,内化FAM-Aβ42(1μ)孵育24小时后,用共焦显微镜观察对照组和LRP1抑制的NT2细胞与溶酶体标记物的共定位。C类,对照组和LRP1抑制的NT2细胞被允许内化Aβ42(1μ)37°C下持续2小时(灰色条);将平行培养物清洗并在缺乏Aβ42(黑条)的培养基中再培养8小时,并通过ELISA进行分析。孵育8小时后内化Aβ的减少被估计为细胞清除率。数据绘制为平均值±标准偏差(n个= 3). *第页< 0.05; **第页< 0.01.
图2。
图2。
神经元中LRP1的缺失加剧了APP/PS1小鼠皮层中Aβ的沉积。一个、来自控制APP/PS1和APP/PS1的皮层;Lrp1号机组−/−小鼠在12个月大时与LRP1抗体和神经元标记物NeuN或星形胶质细胞标记物GFAP共染。比例尺,50μm。B类来自APP/PS1和APP/PS1的皮层LRP1表达;Lrp1号机组−/−6–7日通过Western blot检测小鼠(n个= 4–5), 12–13 (n个=6–7)和18–20个月(n个=5-6)岁。C类从对照APP/PS1和APP/PS1.提取的胍(GDN)中提取的皮层中不溶性Aβ40和Aβ42的浓度;Lrp1号机组−/−小鼠在6–7日通过ELISA分析(n个= 4–5), 12–13 (n个=6–7)和18–20个月(n个=5-6)岁。D类、对照组APP/PS1和APP/PS1脑切片中的Aβ斑块;Lrp1号机组−/−用pan-aβ抗体对小鼠(12-13个月龄)进行免疫染色。比例尺,1 mm。E类,对照组APP/PS1和APP/PS1大脑皮层淀粉样斑块负荷;Lrp1号机组−/−通过阳性像素计数程序(Aperio Technologies)扫描12-13个月大的小鼠Aβ免疫染色后对其进行定量(n个= 6–7).F类,G公司TBS中提取的皮层中可溶性Aβ40和Aβ42的浓度(F类)和TBS-TX(G公司)来自控制APP/PS1和APP/PS1;Lrp1号机组−/−在12–13日通过ELISA对小鼠进行分析(n个=6–7)和18–20个月(n个=5-6)岁。H(H),来自APP/PS1和APP/PS1的小脑LRP1表达;Lrp1号机组−/−小鼠在12–13个月时通过Western blot检测(n个=4),并分析GDN提取的皮层中不溶性Aβ40和Aβ42水平的浓度(). 数据绘制为平均值±SEM*第页< 0.05; **第页< 0.01. N.S.,不显著。
图3。
图3。
Aβ水平与年龄和APP/PS1皮层LRP1的关系;Lrp1号机组−/−老鼠。一个,B类,不溶性Aβ40的相关性(一个)和Aβ42(B类)绘制了大脑皮层随年龄变化的水平。应用程序/PS1(n个=16)和APP/PS1;Lrp1号机组−/−老鼠(n个=16)在6至20个月大时进行分析。C类,D类,不溶性Aβ40的相关性(C类)和Aβ42(D类)绘制了大脑皮层中LRP1的水平。应用程序/PS1(n个=12)和APP/PS1;Lrp1号机组−/−老鼠(n个=11)在12-20个月大时进行分析。LRP1水平通过Western blot定量,并归一化为β-肌动蛋白。数据绘制为与对照APP/PS1小鼠平均值的比值。相关系数(R(右)2)和第页值显示在图表中。
图4。
图4。
神经元中LRP1的缺失并不影响APP的处理以及NEP和IDE的mRNA水平。A–G,PS1等级(一个,B类),全长APP(C类,D类),sAPPα(E类,F类)和sAPPβ(E类,G公司)用Western blot分析APP/PS1和APP/PS1;Lrp1号机组−/−12-13个月大的小鼠(n个= 5).H(H)6–7岁时用ELISA分析CTFβ水平(n个=5)和12-13个月(n个= 5).,对照组和对照组皮层中两种主要Aβ降解酶NEP和IDE的mRNA水平Lrp1号机组−/−小鼠在12个月龄时通过RT-PCR进行定量。数据绘制为平均值±SEM(n个= 6). N.S.,不显著。
图5。
图5。
神经元LRP1缺失抑制APP/PS1小鼠皮层ISF Aβ的清除。一个,B类、APP/PS1和APP/PS1;Lrp1号机组−/−在8-10个月龄时对小鼠进行分析。用γ-分泌酶抑制剂复合物E处理小鼠,并监测5小时内皮层ISF的aβ40水平(一个)在皮质ISF基线后,通过7.5小时的监测达到aβ40水平(B类).C类,D类绘制了ISF Aβ40基线浓度百分比与时间的共同对数(C类). 使用每只小鼠的log[%ISFAβ40]与时间的单个线性回归斜率来计算平均半衰期(1/2)从ISF中消除Aβ(D类). 数据绘制为平均值±SEM(n个= 4–5) *第页< 0.05.
图6。
图6。
APP/PS1小鼠神经元中LRP1的缺失并不影响海马中的Aβ水平。一个,来自对照APP/PS1和APP/PS1的海马;Lrp1号机组−/−小鼠在12个月大时与LRP1抗体和神经元标记物NeuN或星形胶质细胞标记物GFAP共染。比例尺,50μm。B类,来自APP/PS1和APP/PS1的LRP1在皮层的表达;Lrp1号机组−/−12–13日通过Western blot检测小鼠(n个=6–7)和18–20个月(n个=5-6)岁。C类、对照组APP/PS1和APP/PS1海马中不溶性Aβ40和Aβ42水平的浓度;Lrp1号机组−/−12–13日通过ELISA分析小鼠(n个=6–7)和18–20个月(n个=5-6)岁。数据绘制为平均值±SEM**第页< 0.01. N.S.,不显著。D类,E类,不溶性Aβ40的相关性(D类)和Aβ42(E类)绘制海马LRP1水平。应用程序/PS1(n个=12)和APP/PS1;Lrp1号机组−/−老鼠(n个=11)在12-20个月大时进行分析。LRP1水平通过Western blot定量,并归一化为β-肌动蛋白。数据绘制为与对照APP/PS1小鼠平均值的比值。相关系数(R(右)2)和第页值显示在图表中。
图7。
图7。
LRP1神经元Aβ清除模型。APP在内吞作用后在内胚体中被裂解并加工成Aβ,Aβ从神经元分泌到大脑ISF。LRP1在神经元中大量表达,主要在突触后区域和细胞体中。作为一种有效的内吞受体,LRP1介导Aβ的摄取和随后的溶酶体降解。尽管Aβ也通过蛋白水解酶、胶质细胞和脑血管系统被清除,但如本研究所示,LRP1通路的干扰足以诱导Aβ在皮层中的积累和沉积。

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