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.2014年10月2日；33(40):4803-12.
doi:10.1038/onc.2013.421。 Epub 2013年10月21日。

直接结合RAD51C、RAD51和BRCA2的PALB2 WD40结构域的乳腺癌相关错义突变体破坏了DNA修复

J-Y公园 1, T R辛格 1, N纳赛尔 2, F张 1, M弗伦德 三, 哈恩伯格 4, R Meetei先生 2, P R安德烈森 2
附属公司

直接结合RAD51C、RAD51和BRCA2的PALB2 WD40结构域的乳腺癌相关错义突变体破坏了DNA修复

J-Y公园等。 癌基因. .

摘要

BRCA2/FANCD1、PALB2/FANCN和RAD51C/FANCO DNA修复基因的种系突变杂合携带者一生中患乳腺癌、卵巢癌和其他癌症的风险增加；这些基因的双等位基因突变临床表现为范科尼贫血（FA）。在这里，我们证明RAD51C是包含PALB2和BRCA2的新型蛋白质复合物的一部分。此外，PALB2 WD40域可以直接独立地绑定RAD51C和BRCA2。为了了解这些同源重组（HR）蛋白在DNA修复中的作用，我们对已报道的乳腺癌患者中PALB2 WD40结构域错义突变体的作用进行了功能表征。与显示完全失去相互作用的PALB2的大截短相比，PALB2 WD40结构域的L939W、T1030I和L1143P错义突变体/变体与生化分析中与RAD51C、RAD51和BRCA2 HR蛋白直接结合的模式改变有关。此外，T1030I错义突变体是不稳定的，而L939W和L1143P蛋白是稳定的，但部分破坏了细胞中的PALB2-RAD51C-BRCA2复合物。在功能上，L939W和L1143P突变体显示DNA双链断裂诱导HR的能力下降，细胞对电离辐射的敏感性增加。作为HR复合物功能重要性的进一步证据，与癌症易感性和FA相关的RAD51C突变体也显示PALB2复合物形成减少。总之，我们的结果表明，三种不同的癌症易感性和FA蛋白在基于PALB2 WD40结构域与RAD51C和BRCA2结合的DNA修复途径中发挥作用。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突

MF和HH可以根据与Myriad Genetics，Inc.签订的许可协议，获得使用RAD51C作为癌症易感基因的特许权使用费。所有其他作者都声明，他们没有潜在的利益冲突。

数字

图1
图1。RAD51C与PALB2和BRCA2交互
（A） 经HeLa S3细胞免疫纯化后，通过质谱法鉴定的指示RAD51C复合物组分的银染凝胶。RAD51C用N末端His表达6-标记（HF）表位标签。如图所示（左图），将凝胶切割成四个部分，并对每个部分进行质谱分析。括号中显示了从模拟纯化对照品中分离出的普通肽减去后识别出的独特肽的数量。（B） 免疫印迹显示PALB2和BRCA2与HF-RAD51C共免疫沉淀。（C） 免疫印迹显示RAD51C和XRCC3与HF-PALB2共免疫沉淀。（B–C）免疫沉淀物是使用M2抗标记珠和HeLa（B）和EUFA1341细胞的提取物辅以HF-PALB2（C）制备的。（D） PALB2、BRCA2、RAD51C和RAD51形成一种蛋白质复合物，这是由在先前的RAD51免疫缺失后，可以用HF-RAD51C免疫沉淀的复合物的缺失所决定的。HeLa细胞首先与抗RAD51或正常兔（Cont.）抗血清孵育。然后用抗M2琼脂糖孵育上清，以免疫沉淀HF-RAD51C，并用指示的抗体进行免疫印迹。（B–D）免疫沉淀物是输入通道加载水平的200倍。HF-RAD51C和内源性RAD51C或RAD51的位置用箭头表示。
图2
图2。RAD51C直接绑定到PALB2的WD40域
（A） PALB2和选定突变体的示意图。阴影框表示PALB2的WD40重复。（B） 将野生型PALB2和含有N末端Flag和HA表位标签的Y551X截短突变体瞬时转染到293T细胞中。免疫沉淀物是输入通道所载水平的500倍。（C） 用野生型PALB2或P1097后截短的ΔC突变体重组的EUFA1341细胞制备细胞裂解物。RAD51C的位置由箭头指示。（B–C）用α-Flag珠免疫沉淀细胞裂解物，然后用所示抗体进行免疫印迹。（D） 单独使用细菌表达的麦芽糖结合蛋白（MBP）或MBP融合到PALB2的WD40结构域（氨基酸859–1186）进行直接结合分析。细菌表达他的6单独或与RAD51C融合，与固定在麦芽糖珠上的MBP或MBP-PALB2孵育。洗脱后用抗-His抗体免疫印迹法检测结合的RAD51C。
图3
图3。乳腺癌PALB2 WD40结构域突变的位置和潜在影响分析
（A） PALB2的WD40域的带状图以灰色显示（PDB ID 3EU7）。叶片编号为1至7，颜色为浅灰色至深灰色。乳腺癌患者中发现的错义突变/变体（L939、T1030和L1143）以棒状和粉红色显示。（B–C）分别以Leu939和Leu1143为中心的PALB2区域的表面表示，用粉红色表示这两个疏水残基是如何暴露在溶剂中的。（D） 叶片4 T1030周围残留物的详细信息。突出显示了残基E1011和M1032，它们与T1030的羟基形成氢键。图形是用Pymol绘制的(http://www.pymol.org/).
图4
图4。不同的模式在体外RAD51C、BRCA2、RAD51和XRCC3与PALB2的疾病相关错义突变体的结合表明，PALB2 WD40结构域可以将这些蛋白质支架形成复合物
（A） 代表在体外结合实验。MBP单独或MBP融合到野生型PALB2 WD40结构域或该结构域的不同乳腺癌相关突变体/变体中，在细菌中表达、纯化并固定在麦芽糖珠上。分离的MBP-WD40蛋白质或仅MBP显示为“输入”。从细菌中纯化GST标记的BRCA2片段（氨基酸1–75）或His标记的RAD51C、RAD51或XRCC3，并与纯化的MBP融合蛋白孵育。MBP融合蛋白下拉列表中存在的蛋白质根据情况用抗GST或抗-His抗体检测。GST单独作为GST-BRCA2的阴性对照，而His单独作为His与RAD51C、RAD51或XRCC3融合的阴性对照。（B） 显示三个独立实验中结合定量的图表。每个HR蛋白的值通过密度测定法确定，并相对于输入通道中每种形式的PALB2的水平进行调整，显示为归一化为野生型PALB2 WD40结构域的免疫沉淀量。显示了每个值的平均值和标准偏差（*=P<0.05；**=P<0.01）。
图5
图5。乳腺癌相关的PALB2 T1030I突变不稳定
（A） 野生型PALB2或L939W、T1030I和L1143P突变体/变体在EUFA1341细胞中逆转录表达，并带有N末端Flag-HA表位标签。用α-HA抗体免疫印迹法测定每个蛋白的水平。肌动蛋白被用作加载控制。（B） 为了检测相对周转率，用Flag-HA标记的野生型PALB2或用40μg/ml环己酰亚胺处理的T1030I突变体重组的EUFA1341细胞中新的蛋白质合成受到抑制。在指定的时间点制备细胞裂解物。（C） 用野生型PALB2或T1030I突变体重组的EUFA1341细胞用10μM MG132处理并在指定的时间点收获。（D–E）通过免疫印迹密度测定法测定不同时间点用环己酰亚胺（D）或MG132（E）处理后野生型PALB2或T1030I突变体水平的定量。每个蛋白质的结果均归一化为治疗0小时（D）或2小时（E）时的值。（F） 用RT-PCR分析重组EUFA1341细胞中野生型或突变型PALB2 mRNA的水平。利用检测到Flag-HA标记的PALB2而非内源性PALB2的引物。GAPDH被用作无关内源性蛋白水平的对照。
图6
图6。PALB2 WD40结构域的L939W和L1143P突变体与缺陷DSB引发的HR相关，并且对电离辐射的敏感性增加
（A） 在稳定表达野生型PALB2或L939W或L1143P突变体的U2OS-DR细胞中进行基因转换分析，并使用针对其3′-UTR的siRNA去除内源性PALB2。流式细胞术检测GFP阳性细胞。每个值表示重复进行的三个独立实验的平均值。所示数据为三个独立重复的平均值和标准偏差（*=P<0.05；**=P<0.01）。（B） 暴露于10 Gy IR后16小时RAD51病灶细胞的百分比。如图所示，U2OS-DR细胞用不同形式的PALB2稳定重建，内源性PALB2如上所述耗尽。每个值代表150个或更多细胞的3个计数的平均值和标准偏差，每个细胞具有3个或更多RAD51焦点（*=P<0.05）。（C） 在用野生型PALB2、L939W或L1143P突变体或仅用载体重建的EUFA1341细胞中进行IR集落分析。用指示剂量的IR处理细胞。与用WT PALB2校正的细胞相比，用载体或任一突变体重建的EUFA1341细胞在IR剂量为1–8 Gy时的差异具有统计学意义（P<0.05）。（D–E）野生型PALB2、L939W或L1143P突变体或单独载体，与N末端Flag-HA表位标签一起在EUFA1341细胞中稳定表达。提取物（输入）或使用α-Flag M2琼脂糖珠制备的免疫沉淀物（IP）中相关HR蛋白的水平如（D）所示。这些结果代表了两个独立的实验。RAD51C的位置由箭头指示。免疫沉淀物是输入通道所载水平的200倍。在两个独立的实验（E）中用WT、L939W或L1143P形式的PALB2免疫沉淀的BRCA2、RAD51C或RAD51水平的量化。免疫沉淀蛋白的水平标准化为每种形式的PALB2和每种相互作用蛋白的输入。显示了平均+/-S.D.相对于PALB2-WT的值（设置为100%）。统计学显著性：*=P<0.05；**=P<0.01。
图7
图7。RAD51C的疾病相关突变体降低了与BRCA2和PALB2的相互作用
（A） 野生型RAD51C、乳腺癌患者中发现的L138F和D159N突变体，或范科尼贫血患者中找到的R258H突变体，与N末端Flag-HA表位标签一起在293T细胞中瞬时表达。用所示抗体通过免疫印迹法测定提取物（输入）或使用α-标记M2琼脂糖珠（IP）制备的免疫沉淀物中的蛋白质水平。免疫沉淀物是输入通道所载水平的500倍。
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中的注释

  • PALB2 p.Leu939Trp突变与乳腺癌风险无关。
    Catucci I、Radic P、Milne RL、Couch FJ、Southey MC、Peterlongo P。 Catucci I等人。 乳腺癌研究2016年11月9日；18(1):111. doi:10.1186/s13058-016-0762-9。 2016年乳腺癌研究。 PMID：27829436 免费PMC文章。 没有可用的摘要。

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