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.2014年1月；13(1):372-87.
doi:10.1074/mcp。O113.027870号。 Epub 2013年10月15日。

蛋白质甲基化的免疫亲和富集和质谱分析

郭爱兰 1, 顾洪波, 荆州, 丹尼尔·穆尔赫恩, Yi Wang（王怡）, 金伯利·A·李, Vicky Yang女士, 迈克·阿奎尔, 乔恩·科恩豪塞, 贾晓英, 任建民, 肖恩·博索利尔, 杰弗里·西尔瓦, 维迪亚西里·维穆拉帕利, 马克·T·贝德福德, 迈克尔·J·库姆
附属机构

蛋白质甲基化的免疫亲和富集和质谱分析

郭爱兰等。 分子细胞蛋白质组学. 2014年1月.

摘要

蛋白质甲基化是一种常见的翻译后修饰，主要发生在精氨酸和赖氨酸残基上。据报道，精氨酸甲基化可调节RNA加工、基因转录、DNA损伤修复、蛋白质移位和信号转导。众所周知，赖氨酸甲基化可以调节组蛋白功能，并参与基因转录的表观遗传学调节。为了更好地研究蛋白质甲基化，我们开发了针对单甲基精氨酸的高度特异性抗体；不对称二甲基精氨酸；以及单甲基、二甲基和三甲基赖氨酸基序。这些抗体用于甲基肽的免疫亲和纯化，然后进行LC-MS/MS分析，以确定和量化几个模型研究中的精氨酸和赖氨酸甲基化位点。总的来说，我们在人类细胞系和小鼠组织中发现了1000多个精氨酸甲基化位点，在人类细胞株HCT116中发现了约160个赖氨酸甲基化位点。本研究中确定的甲基化位点的数量超过了迄今为止文献中发现的数量。对小鼠大脑中观察到的精氨酸甲基化蛋白与小鼠胚胎中发现的精氨酸甲基化蛋白进行详细分析，显示精氨酸甲酯化的组织特异性分布，并扩展了已知精氨酸甲酰化的蛋白质类型，以包括许多新的蛋白质类型。我们从大脑中发现的许多精氨酸甲基化蛋白，包括受体、离子通道、转运蛋白和囊泡蛋白，都参与突触传递，而从小鼠胚胎中发现的最丰富的甲基化蛋白是转录调节蛋白和RNA处理蛋白。

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数字

图1。
图1。
甲基化抗体的特征。 A类，表示使用肽库方法生成的不同甲基化抗体。B类未经处理或AdOx处理的裂解物的Western blot分析（20μ米，48 h）使用MMA抗体D5A12和Me-R的HCT116细胞4-100（左侧面板）。特定信号被单甲基精氨酸肽（中间面板）阻断，而非甲基精氨酰控制肽（右侧面板）未阻断。C类未经处理或AdOx处理的裂解物的Western blot分析（20μ米，48 h）使用ADMA抗体D4H5和D6A8的HCT116细胞（左侧面板）。特异性信号被抗原ADMA肽（中间面板）阻断，但没有被相应的SDMA控制肽（右侧面板）阻断。将等量的蛋白裂解物（30μg）加载到凝胶中的每个通道中B类和C类，并使用Coommassie染色和β-肌动蛋白信号来确保样品的均匀加载（如所示补充图S3). M、 蛋白质标记车道。D类,E类CARM1野生型（wt）和敲除型（KO）小鼠胚胎成纤维细胞裂解物和PRMT1裂解物的Western blot分析佛罗里达州/-使用两种不对称二甲基精氨酸甲基化（ADMA）抗体D4H5和D6A8，对ER-Cre小鼠胚胎成纤维细胞进行（+）和（-）OHT（三苯氧胺）治疗。D6A8对PRMT1底物更具特异性，在PRMT1 KO细胞（PRMT1佛罗里达州/-ER-Cre，+OHT）。D4H5显示CARM1-和PRMT1-特异性条带，以及一些未被CARM1和PRMT1 KO阻断的条带。β-actin信号作为负荷控制。
图2。
图2。
IAP-LC-MS/MS方法和HCT116细胞的实验结果。 A类，IAP-LC-MS/MS实验的示意性工作流程。从细胞系或组织样品中提取的蛋白质经蛋白质水解消化，所得肽通过Sep-Pak C18盒纯化。将冷冻干燥的肽溶解在IAP缓冲液中，并使用甲基化特异性抗体进行免疫亲和纯化。通过LC-MS/MS分析富集的甲基肽，以确定甲基化位点。B类，从HCT116细胞的IAP-LC-MS/MS实验中确定的甲基化位点。在每个实验中，使用250μg甲基化抗体对HCT116细胞中的10 mg胰蛋白酶肽进行免疫亲和纯化。报告的MMA位点是使用D5A12和使用Me-R的IAP-LC-MS/MS实验的综合结果4-100 MMA抗体。报告的ADMA位点是使用D4H5和使用D6A8 ADMA抗体的IAP-LC-MS/MS实验的综合结果。Kme1、Kme2和Kme3位点分别来自使用BL10749、BL10745和D3978抗体的个体IAP-LC-MS/MS实验。
图3。
图3。
精氨酸甲基化位点的基序和蛋白型分析。 A–CHCT116细胞精氨酸甲基化位点的基序分析。15 mer序列由Motif X生成。位于蛋白质末端七个残基内的位点未用于Motif徽标。频率图由Weblogo生成。A类，使用Me-R确定的1009个MMA站点中4-100抗体，54.7%具有rG基序。B类在用D5A12抗体鉴定的879个MMA位点中，70.4%具有rG基序。C类在D4H5和D6A8 ADMA抗体鉴定的466个ADMA位点中，34.8%具有rG基序。D类,E类，基于PhosphoSite数据库中的注释在HCT116细胞中确定的MMA和ADMA位点的蛋白质类别饼图。大约一半的MMA位点存在于RNA加工蛋白和转录调节因子中。转录调节因子占ADMA位点的大多数（39%），其次是RNA加工蛋白（29%）。F类,G公司根据基因本体术语分类的统计富集的单甲基化（MMA）蛋白质类和不对称二甲基化（ADMA）蛋白质类。显著性表示为−log(第页值）；显著性阈值为1.301=−log(第页= 0.05). 使用DAVID识别在每个数据集中统计上过度表达的基因本体论（GO）术语。绘制了在一个或两个数据集中显著丰富的选定GO项。GO术语列在垂直位置(年)轴线；三大GO类别（分子功能、生物过程和细胞成分）中的每一个术语都被归在一起。在每个主要类别中，每个GO项在两个图中都用相同的条形颜色描述，以帮助比较两个数据集。每个条的长度表示统计显著性，绘制为−log(第页值）；每个条末尾的数字显示了这个值。虚线表示1.3的显著性阈值(第页值=0.05）。每个条形图底部的数字表示数据集中已注释GO术语的基因的百分比。
图4。
图4。
HCT116细胞赖氨酸甲基化分析。 A类未经处理或AdOx处理的裂解物的Western blot分析（20μ米，48 h）通过Kme1、Kme2和Kme3抗体检测HCT116细胞。B类，使用Kme1抗体从HCT116细胞中鉴定出EZH1的单甲基化K736（EZH2的K735）的MS/MS谱。位置确定离子y6和y7定义甲基化残留物。C类HCT116细胞中119个单甲基赖氨酸位点（上面板）的基序表示，其中47个位点在−1位置有亮氨酸（下面板）。
图5。
图5。
小鼠脑和胚胎精氨酸甲基化的定量分析。 A类，通过单甲基精氨酸抗体（MMA:D5A12和Me-R的混合物4-100）和不对称二甲基精氨酸抗体（ADMA：D4H5和D6A8的混合物）。B类，小鼠大脑和小鼠胚胎中确定的MMA和ADMA位点数量的维恩图。C类，两种组织中精氨酸单甲基化位点的定量比较。散点图中的每个点代表使用MMA抗体混合物在小鼠大脑和/或小鼠胚胎中识别的一种独特的精氨酸单甲基化肽。这个x个-axis是小鼠大脑和胚胎中甲基化位点代表性肽总强度的log10值年-axis显示了小鼠脑中肽强度的log2比率与胚胎。设定5倍的截止值，以表明大脑（绿点）或胚胎（红点）中精氨酸单甲基化肽的丰度增加。对于特定组织中唯一存在的甲基肽，指定了15（大脑特异性）和-15（胚胎特异性）的任意log2比率。图中突出显示并标记了几个典型的富含甲基化蛋白的大脑（BSN、MBP、SYN1、SNIP、SHANK1）和胚胎（GATAD2A、PABP1、FOXK1、NF-GMB）。D类Western blot证实小鼠脑和小鼠胚胎裂解物中SNIP和PABP1甲基化。用MMA抗体（D5A12和Me-R的混合物）免疫沉淀来自小鼠大脑和小鼠胚胎的总蛋白裂解物4-100），并通过SNIP、PABP1、MMA和泛素抗体进行免疫印迹*SNIP印迹中SNIP以下的非特异性条带**IgG带。
图6。
图6。
大脑示意图(A类)和胚胎(B类)根据蛋白质类型和定位富集单甲基精氨酸蛋白质。甲基化蛋白质的强度比是通过对属于同一蛋白质的所有位点的强度比进行平均来计算的。将阈值设为5倍，表明大脑中精氨酸单甲基化蛋白的丰度显著增加(A类)或胚胎(B类). 图中仅显示了来自“受体/通道/转运体”、“适配器/支架”、“囊泡蛋白”、“G蛋白和调节器”、“翻译”、“染色质/DNA结合”、“DNA修复/复制蛋白质”、“RNA处理”和“转录调节器”蛋白质类的蛋白质。圆圈的大小适合蛋白质名称，与折叠变化无关。
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