跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2013年9月；33(18):3644-58.
doi:10.1128/MCB.00302-13。 Epub 2013年7月15日。

CD81控制持续的T细胞激活信号并定义同源免疫突触的成熟阶段

V罗查·佩鲁吉尼 1, M Zamai先生, J M González-Granado先生, O巴雷罗, E特杰拉, M Yañez-Mó, V R Caiolfa公司, F桑切斯-马德里
附属公司

CD81控制持续的T细胞激活信号并定义同源免疫突触的成熟阶段

V罗查·佩鲁吉尼等。 分子细胞生物学. 2013年9月.

摘要

在本研究中，我们研究了T淋巴细胞中四spanin CD81分子相互作用的动力学，我们发现CD81控制免疫突触（IS）的组织和T细胞的激活。使用定量显微镜，包括光漂白后的荧光恢复（FRAP）、相量荧光寿命成像显微镜Föster共振能量转移（phasorFLIM-FRET）和全内反射荧光显微镜（TIRFM），我们证明CD81在T细胞和抗原呈递细胞（APC）之间的结合过程中与ICAM-1和CD3相互作用。CD81和ICAM-1在早期和晚期T细胞-APC接触的中央和外围区域表现出明显的活动性。此外，随着IS形成的时间进程，CD81-ICAM-1和CD81-CD3动态相互作用增加，因为这些分子在整个接触区域重新分布。因此，CD81关联意外地定义了IS成熟的新序列步骤。我们的结果表明，CD81控制IS的时间进程和CD3在膜接触区的持久性，有助于T细胞受体（TCR）-CD3介导的持续信号传导。因此，我们发现CD81是T细胞适当活化、调节CD3ζ、ZAP-70、LAT和细胞外信号调节激酶（ERK）磷酸化所必需的；CD69表面表达；白细胞介素-2（IL-2）分泌。我们的数据证明了CD81在IS结构的分子组织和动力学中的重要作用，IS结构设置T细胞激活的信号阈值。

PubMed免责声明

数字

图1
图1
在IS处富集CD81、CD3和ICAM-1。将原代人T淋巴细胞与CMAC标记的SEE负载的Raji B细胞（蓝色）（星号）偶联10或30分钟。然后将细胞接种在PLL涂布的盖玻片上，固定，并用抗CD81（红色）和CD3或ICAM-1（绿色）的抗体染色。图中显示了一个共焦平面。棒材，10μm。
图2
图2
CD81、CD3和ICAM-1重定标取决于IS成熟度。转染CD81-mCherry和CD3ζ-mEGFP（A）、CD81-mCherry和ICAM-1–mEGFP的J77细胞，或CD3ξ-mEGFP（C）与Raji/SEE细胞结合（蓝色）（星号）。通过延时共聚焦显微镜以约1.5分钟的间隔监测细胞。图中显示了一个共焦平面。棒材，10μm。在面板A和B中，右图表示共轭期间3D IS接触区mEGFP-mCherry共定位的皮尔逊系数测量值。在CD3ζ-mEGFP和CD81-mCherry（A）或ICAM-1–mEGFP以及CD81-mCherry（B）IS的延时叠加共焦图像上进行测量，如左图所示。数据是16（A）和11（B）个单元格平均值的平均值±标准误差(n个=每个独立实验2次）。
图3
图3
IS.J77/CD81-mCherry（A到E）或J77/ICAM-1–mEGFP（F到J）细胞的CD81和ICAM-1动力学与Raji/SEE细胞（星号）结合。FRAP在早期和晚期IS的cSMAC或pSMAC上以及在未偶联的T细胞上进行。数据通过Tukey’s单因素方差分析进行分析事后（post-hoc）多重比较试验。（A） 以伪彩色强度编码格式（最大强度为白色）描述的预漂白、漂白和最终漂白后图像示例：白色圆圈、漂白区域；绿色圆圈，膜区远离漂白区，用作内部控制；红色圆圈，背景。（B） 非共轭细胞的平均荧光恢复曲线±平均值标准误差(n个=12），cSMAC(n个=11）和pSMAC(n个=10）早期IS.（C）平均荧光恢复±非结合细胞平均值的标准误差（与B组曲线相同），cSMAC(n个=9）和pSMAC(n个=13）。（D和E）条形直方图显示了根据拟合曲线计算的固定分数（D）和半恢复时间（E）。（F） 如上文所述，面板A的伪彩色图像示例。（G）拟合荧光恢复曲线±非共轭细胞平均值的标准误差(n个=15），cSMAC(n个=11）和pSMAC(n个=12）早期IS。（H）非结合细胞的平均荧光恢复（曲线如面板G所示），cSMAC(n个=10）和pSMAC(n个=10）。条形直方图显示了不动部分（I）和半恢复时间（J）。ns，不显著。
图4
图4
用mEGFP-mCherry对共转染的IS.J77细胞，CD81与ICAM-1和CD3相互作用，与Raji/SEE细胞偶联，并用相量FLIM-FRET分析。数据采用Bonferroni的单因素方差分析事后（post-hoc）多重比较试验。（A） 早期和晚期IS中CD9-CD81对的FRET-FLIM检测示例（星号标记Raji B细胞位置）。在每个图表中，EGFP寿命分布显示在相量图中，其中绿线和红线分别标记为0和50%FRETeff。相量图中的黑色圆形光标通过红色遮罩（每个图表中的右侧图像）选择相关FLIM图像中显示的像素子集。mEGFP荧光强度以灰度表示（每个图表中的左侧图像）。该图显示了无IS（仅T细胞）的高FRETeff像素百分比的量化(n个=7），非特异性接触(n个=4），初始同源接触(n个=7），早期IS(n个=7）和后期IS(n个= 7). （B） 早期和晚期IS中ICAM-1–CD81对的FRET-FLIM检测示例，如上文所述针对面板A进行分析。该图显示了高FRETeff像素百分比的量化：无IS(n个=8），初始同源接触(n个=12），早期IS(n个=5）和后期IS(n个=12）。（C） 早期和晚期IS中CD3ζ-CD81对的FRET-FLIM检测示例，如上文对面板A所述进行分析。该图显示了高FRETeff像素百分比的量化：无IS(n个=6），非特异性T细胞-B细胞接触(n个=4），早期IS(n个=10）和后期IS(n个= 20).
图5
图5
CD81控制IS组织。（A） 用对照siRNA或siCD81和ICAM-1–mEGFP共转染J77细胞，进行CD81染色，并进行流式细胞术分析。阴性对照物为灰色，表示细胞仅被二级抗体染色。（B） J77/ICAM-1–用对照或CD81 siRNA处理的mEGFP细胞与Raji/SEE细胞结合，并量化早期或晚期IS中结合物的百分比（由ICAM-1分布监测）。数据为100个触点平均值的平均值±标准误差(n个＝3个独立实验）。右侧面板是ICAM-1–mEGFP分布和合并的亮场和蓝色通道（Raji/SEE）的伪彩色图像示例（星号）。（C） J77/shControl或J77/sh CD81细胞与Raji/SEE细胞孵育指定时间。数据表示CD3表面表达水平相对于shControl细胞中未激活Raji细胞（0 min）水平的折叠变化，并显示为平均值±平均值标准误差(n个=5，一式三份）。（D） J77/shRNA T细胞与Raji/SEE B细胞（SEE）偶联（左），或CH7/siRNA T细胞和Hom2/HA B细胞（HA肽）偶联（右）20分钟，并测量CD3对IS的重定位。数据是50（SEE）和100（HA）共轭平均值的平均值±标准误差(n个=每个独立实验2次）。
图6
图6
CD81在IS处调节CD3动力学。（A，左）对与对照siRNA或siCD81和CD3ζ-mEGFP共转染的J77细胞进行流式细胞术分析，并对其进行CD81染色。阴性对照物为灰色，表示细胞仅被二级抗体染色。将经siControl或siCD81处理的J77/CD3ζ-mEGFP细胞镀在CD3涂层盖玻片上，并通过TIRFM进行分析。（右）siRNA-处理细胞的细胞膜上CD3ζ-mEGFP微簇的时间最大投影的伪彩色图像示例。（B到E）显示每个CD3微簇的检测持续时间（B）、轨迹的平均速度（C）以及每个时间点的微簇数量（D）和cSMAC区域（E）的图形。数据为每种条件下8个细胞平均值的平均值±标准误差(n个=2个独立实验）。
图7
图7
CD81控制IS的形成。（A） 用CD81 shRNA或空载体（shControl）转导J77细胞，进行CD81染色，并用流式细胞术进行分析。阴性对照表示细胞仅被二级抗体染色。（B） 流式细胞术测定CD81缺失与否T细胞膜蛋白的表达水平（shControl）。差异无统计学意义。数据以对照细胞中每个蛋白质表达水平的倍数变化表示，并以三个独立实验的平均值±标准偏差表示。（C） J77/shRNA细胞与Raji/+SEE或Raji/−SEE细胞孵育20分钟，并量化T细胞-B细胞接触的百分比。数据为100个触点的平均值±标准误差(n个=3个独立实验），由Bonferroni的单向方差分析确定事后（post-hoc）多重比较试验。（D） J77/shRNA细胞与Raji/+SEE或Raji/−SEE细胞偶联20分钟，并用抗管蛋白染色。数据是距IS的MTOC距离（μm），显示为100个共轭平均值的平均值±标准误差(n个=3个独立实验），由Bonferroni的单向方差分析确定事后（post-hoc）多重比较试验。（E） 将J77/shRNA细胞与Raji/SEE细胞偶联20分钟，并测量F-actin对IS的重新定位。数据为50个共轭物平均值的平均值±标准误差(n个=2个独立实验）。（F） 用抗CD3刺激J77/shRNA细胞，固定，用指骨肽标记，流式细胞仪分析。数据是在没有抗体（0分钟）的情况下，F-actin含量相对于表达水平的倍数变化，显示为平均值±平均值的标准误差(n个=3个独立实验，一式三份）。
图8
图8
CD81调节T细胞激活阈值。（A） CD81敲低的J77或CH7C17 T细胞分别与Raji/SEE（SEE）和Hom2/HA（HA-肽）B细胞结合指定时间。然后裂解细胞并免疫印迹磷酸化和总CD3ζ、ZAP-70、LAT和ERK1/2。印迹来自三个代表性实验中的一个；印迹下方的数字表示磷酸化/总信号比率。（B和C）J77/shRNA与Raji/SEE或CH7/shRNA与Hom2/HA细胞偶联16 h。（B）细胞标记CD69并进行流式细胞术分析。数据是CD69表面表达水平相对于shControl细胞水平的折叠变化，显示为平均值±平均值标准误差(n个=4[SEE]和n个=5[HA]独立实验）。（C） 上清液通过酶联免疫吸附试验进行分析。数据是分泌IL-2水平相对于shControl细胞水平的倍数变化，显示为平均值±标准误差(n个=3[SEE]和n个=4[HA]独立实验）。（D） 用可渗透的CD81或扰序肽预孵育的CH7 T细胞与Hom2/HA细胞偶联16小时。数据是CD69表面表达水平相对于对照细胞的倍数变化，显示为平均值±平均值的标准误差(n个=2个独立实验）。（E） 与GST单独或GST-LEL-CD81融合蛋白预孵育的CH7 T细胞与Hom2/HA细胞偶联16 h。数据是CD69表面表达水平相对于对照细胞的倍数变化，显示为平均值±标准误差(n个=2个独立实验）。
图9
图9
根据结合1小时期间T细胞APC接触区的蛋白质再分配（CD81、ICAM-1和CD3）定义IS阶段：初始同源接触，其特征是极化T细胞和刺激APC之间的膜接触；早期IS，显示cSMAC（CD3和CD81）或pSMAC（ICAM-1）的差异蛋白富集；IS晚期，整个IS接触区的蛋白质分布均匀。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. 横须贺T，斋藤T。2010年。免疫突触、TCR微簇和T细胞激活。货币。顶部。微生物。免疫学。340:81–107-公共医学
    1. Dustin ML、Olszowy MW、Holdorf AD、Li J、Bromley S、Desai N、Widder P、Rosenberger F、van der Merwe PA、Allen PM、Shaw AS。1998年。一种新的衔接蛋白协调T细胞接触中的受体模式和细胞骨架极性。手机94:667–677-公共医学
    1. Monks CR、Freiberg BA、Kupfer H、Sciaky N和Kupfer A.1998年。T细胞超分子活化簇的三维分离。自然395:82–86-公共医学
    1. Lillemeier BF、Mortelmaier MA、Forstner MB、Huppa JB、Groves JT、Davis MM。2010年。TCR和Lat在T细胞膜上的单独蛋白岛上表达，并在激活期间串联。自然免疫学。11:90–96-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Varma R、Campi G、Yokosuka T、Saito T、Dustin ML.2006年。T细胞受体-最大信号维持在外周微簇中，终止于中心超分子活化簇。免疫25:117–127-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型