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.2013年6月；24(12):1918-32.
doi:10.1091/mbc。E12-11-0840。 Epub 2013年4月24日。

内布林结合阻碍突变结蛋白纤维组装

劳拉·K·贝克 1, 大卫·C·吉利斯, 萨里卡·夏尔马, 安迪·安布罗斯, 哈拉尔德·赫尔曼, Gloria M Conover公司
附属公司

内布林结合阻碍突变结蛋白纤维组装

劳拉·K·贝克等。 分子生物学细胞. 2013年6月.

摘要

结蛋白中间丝（DIF）形成复杂的网状结构，在横纹肌细胞内组织肌纤维。调节结蛋白与肌节结合的机制及其在结蛋白病中的作用尚不完全清楚。在这里，我们比较了雾化蛋白结合对结蛋白和三种导致结蛋白病的突变结蛋白变体的组装动力学的影响，这些突变结蛋白变体在结蛋白的头、杆或尾结构域中携带突变（S46F、E245D和T453I）。选择这些突变体是因为突变的残基位于结蛋白的星云结合区域。我们发现，尽管星云蛋白M160-164与结蛋白四聚体复合物和成熟丝结合，但当与星云蛋白结合时，所有三个突变体都表现出显著延迟的丝组装动力学。相应地，所有三个突变体都显示出相对于野生型结蛋白，星云蛋白的结合亲和力和能力增强。电子显微照片显示，星云与体外组装的细长正常和突变DIF相关。此外，我们在活细胞成像实验中测量了突变结蛋白E245D相对于野生型结蛋白在光漂白后荧光恢复中的显著延迟动力学。我们提出了一种机制，通过在Z盘附近保留星云蛋白，突变体结蛋白减缓心肌细胞结蛋白重塑。根据这些数据，我们认为，对于一些丝状形成结蛋白突变体，结蛋白病的分子病因学是由于它们与纹状肌主要肌动蛋白结合丝蛋白星云蛋白的关联存在细微缺陷所致。

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图1：
图1：
在心肌细胞中，内布林模块164与Z盘的一侧相邻。（A） desmin和星云的布局。Desmin由一个α-螺旋盘绕螺旋杆中心区域组成，该中心区域与非α-螺旋头部和尾部区域接壤。假设结蛋白的杆状结构被细分为前线圈结构域（pcd）和线圈1A、连接子L1、线圈1B、连接子L2和线圈2结构域，如波形蛋白（Nicolet）的报道等., 2010). 显示了本研究中使用的结蛋白突变S46F/Y（头部）、E245D（线圈1B）和T453I（尾部）以及随机突变K190A（线圈1B）的定位。Nebulin含有184个肌动蛋白结合单模块（M），短片段由含有SDxxYK基序的35个氨基酸串联重复序列形成。这些模块被组织成由七个包含WLKGIGW基序的模块组成的超重复序列。星云的N末端富含谷氨酸（酸性区域），在其C末端附近有一个SH3结构域。对与结蛋白相互作用至关重要的星云模块以黄色显示（Bang等.，2002），与结蛋白亲和力最高的以红色显示（Conover等., 2009). （B） 犬肌肉组织与星云蛋白M164（绿色）和结蛋白（红色）共染。尽管在分析的所有三种类型的肌肉（b、e、h）中都检测到结蛋白，但这些图像显示，骨骼肌（a）中的星云蛋白强度最高，心脏或平滑肌（d、g）中的表达量较低。棒材，10μm。
图2：
图2：
结蛋白和星云蛋白在原代心肌细胞和肌肉组织中的分布模式。（A） 对用于产生定制肽抗体的星云模块164（5766–5787）中的22肽进行一级序列分析。该肽的Blastp和ClustalW（版本1.83）比对显示，对于所分析的不同物种（人类、猿类、犬科动物和啮齿动物），星云中有一个高度保守的区域。相反，当与小鸡星云蛋白对齐时，该肽只有54%的相同氨基酸。（B） 大鼠腰大肌骨骼肌显示出明显的结蛋白（红色）条纹，似乎环绕着每个Z盘，而星云M164（绿色）则紧邻或沿着这些结蛋白条纹分布（见插图）。棒材，10μm。（C） 星云蛋白M164（绿色）和Z盘标记物α-肌动蛋白（红色）共同染色的原代心肌细胞显示出强烈的核染色。此外，α-肌动蛋白染色显示肌肉细胞肌节的Z盘上有清晰的条纹，而星云M164在Z盘周围富集。插图显示星云丝状物从Z盘向两个方向向外投射。棒材，10μm。（D） 重组星云蛋白M160–164被针对星云蛋白模块164的肽抗体识别，并且不会与星云M1–5发生交叉反应。使用以下抗体的标准蛋白质印迹条件探测N-末端His标记的雾化蛋白M160-164重组蛋白（泳道1-4）或雾化蛋白M1-5（泳道5和6）的免疫印迹和相应的总蛋白染色（胭脂红S，泳道1、3和5）：抗雾化蛋白M164抗体（泳道2和6）或商业性抗-His抗体（第4道）。Blots检测到与重组星云M160–164片段中含有星云蛋白的条带的预期大小相对应的～21-kDa带，但在含有星云M1–5的条带中发现很少或没有反应性。
图3：
图3：
Desmin包含星云蛋白的多个结合位点。高速共沉积用于确定特定结蛋白结构域是否优先与星云碎片结合。纯化包含一个（杆状、无头、无尾）或所有结蛋白结构域的四个重组蛋白，并在37°C的缓冲条件下与包含模块160–164的星云蛋白重组片段共组装1小时，以促进结蛋白纤维组装。（A） 考马斯染色SDS-PAGE凝胶显示，每个样品分为总量（T）、上清液（Sup）、蔗糖（Suc）和颗粒（P）。无头、杆状和星云大部分是可溶的，而全长和无尾结蛋白都沉积在颗粒中（顶部）。当将星云蛋白M160–164添加到全长结蛋白或任何测试的结蛋白截短蛋白中时，所有这些蛋白都结合，如星云蛋白与每个蛋白共沉淀所示。（B） 本试验中使用的结蛋白片段的示意图。
图4：
图4：
内布林M160–164与结蛋白低聚物结合。在20°C的0.2 mM磷酸钠（pH 7.5）缓冲系统中，通过沉降速度分析评估了星云蛋白M160–164和结蛋白低聚物之间的关联。（A） 在40000 rpm的转速下，当使用10倍的星云蛋白（100μM星云蛋白加上9.3μM结蛋白）时，检测到结蛋白和星云蛋白M160–164之间存在强烈的相互作用。与单独的星云相比，混合样品（红色图）曲线下区域的星云减少了约50%（蓝色图）。在这些条件下，结蛋白沉积在～11S，如之前报告的那样（黑色）。（B） 在20000 rpm的转速下，星云蛋白与结蛋白单独（黑色）的不同摩尔比如下：0.9（蓝色）、2.3（绿色）、4.7（青色）、9.3（红色）和0（粉红色）μM。与1:1的比例（红色）相比，星云蛋白相对于结蛋白的两倍过量显著减少了～11S结蛋白曲线下的面积（粉红色），表明游离结蛋白低聚物的浓度降低。（C） 在30000 rpm的转速下，对于1:2的结蛋白与星云的摩尔比（7.5μM结蛋白与16μM星云），结蛋白-星云复合体在～20到30 S之间表现出广泛的沉积速度，这可以从结蛋白单独沉积剖面上方的深蓝色曲线（水溶液）中得到证明。为了进行比较，我们还单独评估了星云（绿色）。
图5：
图5：
内布林结合延迟突变结蛋白组装成细丝。共沉淀分析评估了在促进结蛋白二聚体和四聚体形成或纤维组装的条件下，WT和突变结蛋白与星云蛋白相互作用的效率。（A） 对，在不含盐的摩尔比为1:1的5 mM Tris（pH 7.4）中透析的蛋白质的共沉淀分析；左图为盐条件下促进结蛋白纤维组装的平行分析（+100 mM NaCl）。在这两种情况下，在超速离心之前，蛋白质在37°C下培养1小时。（B） 使用ImageJ软件通过带密度测定法定量颗粒中回收的结蛋白或星云蛋白的数量。绘制的是从三个独立实验中获得的平均偏差和标准偏差。条形图显示了在没有盐（黑条）或存在盐（白条）的情况下，颗粒中回收的蛋白质百分比。对于每种情况，在第三个条形图（desmin的强度测量值）和第四个条形图中绘制聚集分数。
图6：
图6：
与星云蛋白M160–164相关的突变结蛋白E245D的延迟动力学特征。重组星云蛋白M160–164与体外组装的WT和突变结蛋白E245D细丝紧密结合。（A） 使用促进结蛋白丝形成的组装条件进行动力学共沉淀测定。（B） 使用ImageJ测量颗粒中结蛋白（a）和星云带（B）的凝胶带密度，并绘制成时间函数。与WT结蛋白相比，与突变结蛋白E245D共培养时，星云蛋白的造粒行为显著延迟（对比图4B，b中的红色与黑色图）。绘制的值显示了三个独立实验的平均值。
图7：
图7：
突变体结蛋白以pH依赖的方式与星云蛋白M160–164结合，具有更高的亲和力和容量。在pH 7.4和8.4的ELISA中比较了星云蛋白M160–164与WT结蛋白或突变结蛋白（S46Y、E245D和T453I）的结合。图显示了在相同实验条件下，WT和每个突变株与星云蛋白的归一化平均结合。曲线显示了使用Michaelis–Menten方程进行的七个或八个WT结蛋白实验和两个或三个突变结蛋白实验的非线性拟合平均值。数值显示平均值±SD。（A）当结蛋白蛋白透析至5 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、1 mM-EGTA、pH 7.4时，与WT相比，ELISA显示出所有测试突变体的结合能力和亲和力增加。（B） 当所示结蛋白透析至5 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、1 mM-EGTA、pH 8.4时，与WT相比，突变体的结合能力和对星云蛋白的亲和力没有差异。表1列出了所有测量值的平均值K（K）d日和B类最大值每个实验获得的值。
图8：
图8：
内布林与WT和突变体结蛋白丝相关。WT结蛋白和突变结蛋白E245D（a和d）的负染色组装产物的电子显微照片显示了它们与星云蛋白M160–164（c和f）的相互作用。将结蛋白复性为5 mM Tris-HCl（pH 8.4），并通过在37°C下添加20 mM Tris-HCl加50 mM NaCl（pH 7.0）缓冲液30分钟进行组装。组装产物被允许附着在网格上10秒。重组星云蛋白片段与组装的成熟IF以1:1的WT结蛋白摩尔比孵育30分钟（c）或结蛋白E245D（f）10分钟。星云蛋白碎片产生小结构（箭头，b）和少量制备的微聚集体（e）。星云碎片并入结蛋白丝，穿过结蛋白丝（箭头，c）。观察到星云蛋白与突变结蛋白E245D细丝紧密结合，导致结蛋白细丝打结（箭头，f）。条形，100 nm。
图9：
图9：
活心肌细胞中结蛋白和细丝蛋白的动力学。FRAP比较了活心肌细胞中GFP-星云蛋白M163-170和GFP-肌钙蛋白（Tmod）的动力学，以及结蛋白GFP-coil 1B和其突变体K190A和E245D的动力学。（A） 心肌细胞的实时图像显示了光漂白后GFP-Tmod荧光的恢复。箭头指向肌原纤维上的光漂白感兴趣区域，位于细纤维的尖端，靠近肌节的M线。（B，D）荧光强度归一化为漂白水平为零，荧光恢复率绘制为漂白后时间的函数。荧光回收率的最佳拟合值是一个单相关联方程，半衰期由该方程得出(t吨1/2)进行了计算。（C，E）比较平均半衰期的条形图(t吨1/2)为每种蛋白质获得。计算的平均回收半衰期如下：GFP为0.9 ms；星云碎片为2.3ms；对于Tmod，1.3 ms；对于线圈1B，1.2 ms；对于线圈1B K190A，1.1毫秒；对于线圈1B E245D，1.7 ms。数据显示，相对于仅表达GFP的细胞，星云蛋白、对流层调节蛋白和突变结蛋白GFP-coil 1B E245 D明显较慢，而GFP-cool 1B或其K190A突变的差异不显著。显示每个样品分析的细胞数量(n个)在每列下面。数值显示平均值±SD。星号表示与仅表达GFP的细胞相比存在显著差异(*第页< 0.05; **第页< 0.01; 学生的未婚t吨测试）。
图10：
图10：
星云蛋白与突变结蛋白结合的模型。在该模型中，能够进行丝组装的突变连蛋白以改变的化学计量与星云蛋白强烈结合，减缓连蛋白周转的动力学，在肌节Z带附近的肌动蛋白细丝末端保留和延迟星云蛋白的流动性（DIF被描绘为圆柱体）。我们预测星云蛋白在与突变结蛋白结合时会改变其构象（注意，星云蛋白与WT结蛋白结合后表现为黄色圆圈，与突变结素结合时表现为六边形）。我们认为，这种改变的联系间接并最终导致肌动蛋白丝稳定性的逐渐丧失，干扰肌动蛋白-肌球蛋白的跨桥动力学。为了清楚起见，绘制了WT结蛋白（蓝色）和突变结蛋白杆（红色）以及星云M160–164模块（而不是多模式全长分子）。
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