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.2013年5月；31(5):426-33.
doi:10.1038/nbt.2561。 Epub 2013年4月14日。

转录因子介导的成纤维细胞重编程为可膨胀的少突胶质细胞祖细胞

法迪·J·纳吉姆 1, 安吉拉·M·拉格, 安妮塔·扎伦巴, 克里斯塔·怀亚特, 安德鲁·卡普拉里奥, 丹尼尔C因子, 罗伯特·T·卡尔, 前田忠雄, 罗伯特·米勒, 保罗·J·特萨
附属公司

转录因子介导的成纤维细胞重编程为可膨胀的少突胶质细胞祖细胞

法迪·纳杰姆等。 Nat生物技术. 2013年5月.

摘要

多发性硬化症和白质营养不良等髓鞘疾病的细胞治疗需要技术来生成功能性少突胶质祖细胞。在这里，我们描述了使用八或三组定义的转录因子将小鼠胚胎和肺成纤维细胞直接转化为诱导的少突胶质细胞前体细胞（iOPC）。iOPC具有两极形态和全球基因表达谱，与真正的OPC一致。它们可以在体外扩增至少五代，同时保持分化为多进程少突胶质细胞的能力。当移植到低髓鞘小鼠体内时，iOPC能够包裹宿主轴突并生成致密髓鞘。体细胞向可膨胀iOPC的世系转换为研究少突胶质细胞谱系身份的分子控制提供了一种策略，并可能有助于神经疾病建模和自体再髓鞘化治疗。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争性金融利益

P.J.T.、R.H.M.和F.J.N.正在申请这项技术的专利。

数字

图1
图1。八种转录因子可将小鼠胚胎成纤维细胞重编程为诱导的少突胶质祖细胞
a、，Plp1:eGFP/rtTA成纤维细胞转录因子介导的重编程至诱导少突胶质细胞祖细胞（iOPC）的实验设计概述和时间表，这些细胞可膨胀并能够分化为诱导少突细胞（iOLs）。修饰的Plp1:eGFP转基因在OPC和OLs中表达体内.b、，基因表达热图显示三个主要CNS谱系中每一个的转录因子（TF）富集（黄色）（完整的基因列表见补充表1）。c、，代表性流式细胞仪图和在OPC培养条件下21天后Plp1:eGFP+细胞的平均百分比：未感染和未诱导细胞（无TFs−Dox）；非感染和诱导细胞（无TFs+Dox）；感染8TFs但未诱导（8TFs−Dox）；感染8TFs并诱导（8TFs+Dox）。只有8TFs感染和诱导才能在第21天产生Plp:eGFP+细胞（8TFs+Dox=32.4%+/-9.9%；n=19个来自3个独立批次慢病毒的独立生物复制品）。所有其他条件在第21天都没有Plp1:eGFP+细胞（<0.1%）。日期：，Plp:eGFP MEF培养物的代表性活细胞荧光图像，这些培养物感染了含有8TF池的诱导慢病毒，并在没有（−Dox）或存在（+Dox）TF诱导的情况下培养21天。比例尺，50μm（d）。
图2
图2。八种转录因子诱导的MEF表现出以下特性真诚地OPC公司
a、 b、，相控图像突出显示了未诱导21天8TF之间的显著形态学差异(一; −Dox）和诱导(b条; +Dox）MEF。非重编程细胞表现出典型的成纤维细胞形态（黑色箭头），而8TF诱导的部分培养物表现出OPC的特征性双极形态（白色箭头）。c、，第21天8TF诱导的MEF在少突胶质细胞分化培养基中传代3天的相控图像显示了诱导的少突胶质纤维细胞（iOL；绿色箭头）的生成，显示了少突胶质的独特多处理形态。d–f日，从8TF诱导的MEF中分化出的iOL的代表性免疫荧光图像，包含Plp1:eGFP报告子并表达成熟少突胶质细胞MBP的特异性和定义性标记(d日)、MAG(e（电子）)和MOG(（f）).克，比较多能干细胞衍生的z评分全球基因表达值的聚类热图真诚地OPC、8TF诱导的MEF（8TFs+Dox）、MEF和未感染的MEF加强力霉素（无TFs+Domx）。该图按OPC特异性基因位于顶部、MEF特异性基因位于底部的顺序排列，包括至少一个样本中存在高于背景的信号的>13000个基因。标尺，50μm(一)，100微米(b、 c（c）)，25微米(d–f日).
图3
图3。八种转录因子诱导MEF产生致密髓鞘
a、，测试8TF诱导的MEFs髓鞘形成轴突能力的实验方案在体外将.8TF诱导的MEF移植到P5中颤抖者前脑切片培养10天。b、，MBP+髓鞘束的代表性免疫荧光图像是在移植到冠状前脑切片培养物中10天后由扩张的（第3代，第32天）8TF诱导的MEF生成的颤抖者突变小鼠（由于缺乏兆比特).c–e，供体8TF诱导的MEF移植到冠状前脑切片培养10天后产生的多层致密髓鞘（黑箭头）的电子显微图像颤抖者突变小鼠。f、，测试8TF诱导的MEF对髓鞘轴突能力的实验方案体内将8TF诱导的MEF移植到P3-4的脊髓背侧颤抖者突变小鼠。g、 小时，代表性免疫荧光图像(克)和匹配的甲苯胺蓝（tol-blue）染色切片(小时)8TF诱导的细胞（含Plp1:eGFP转基因）移植到脊髓背侧9天后出现定位颤抖者突变小鼠（n=4只）。虚线表示脊髓背侧的软脑膜。(小时，插图）黑匣子的放大视图(小时)显示大量由8TF诱导的细胞生成的有髓轴突。i–j，MBP的代表性免疫染色显示髓鞘在颤抖者8TF诱导的MEF移植后9天的宿主为供体来源(我). 相同处理的野生型对照染色如所示(j个).k、，8TF诱导的MEFs移植到脊髓背侧9天后产生多层致密髓鞘的电镜图像颤抖器突变小鼠。主要密集线明显，用黑色箭头表示。l–n，野生型背柱轴突的电子显微照片(我)，未经处理颤抖者背柱轴突(米)、和颤抖器8TF诱导的MEF移植后脊髓轴突髓鞘化(n个).o个计算野生型的g比率体内脊髓（0.69±0.07），体内颤抖脊髓（0.88±0.05）和8TF诱导的MEF(在体外切片：0.68±0.07和体内脊髓：0.70±0.07）髓磷脂。使用双尾Student t检验比较野生型和其他各组之间的差异（***p<2.2×10−16野生型vs。颤抖者所有其他不重要）。标尺，25μm(b条)，2微米(c（c）,我–n个)1微米(d日)，500纳米(e（电子）)，100微米(克,小时)，100纳米(k个)和10μm(我,j个)
图4
图4。A2B5免疫分类可用于iOPC的前瞻性富集
a–c，强调8TF诱导MEF双极形态的相位对比图像（在第21天对Plp1:eGFP和A2B5进行分类；表示为8TF A2B5+iOPC）(一)与相比真诚地OPC公司(b条)、和MEF(c（c）).d日，将8TF A2B5+iOPC与图2g中相同的三个对照细胞样品进行比较的z评分全局基因表达值的聚类热图[MEFs、未感染的MEFs加多西环素（无TFs+Dox）和多能干细胞衍生的真诚地OPCs]。Plot按OPC特异性基因排列在顶部，MEF特异性基因排序在底部，包括至少一个样本中有超过13000个背景以上信号的基因。e、 f、，对数的成对比较2-用MEF调整8TF诱导的A2B5+iOPC的全局基因表达值(e（电子）)和真诚地OPC公司(（f）). 蓝线表示基因表达的2倍差异。特征MEF富集（Thy1）和OPC富集（所有其他引用的）基因用红色箭头表示。g、 小时，8TF A2B5+iOPC移植后10天收集的共聚焦图像，包含Plp1:eGFP报告子，在第3代，移植到冠状前脑切片培养中颤抖者突变体小鼠表现出8TF A2B5+iOL广泛包裹神经元轴突。用抗神经丝（NF）和抗GFP抗体的iOL观察神经元。胼胝体（cc）用白色虚线表示。放大的插图显示在每个图像的右侧。标尺，50μm(a–c、g、h)和10μm(g、 小时插图）。
图5
图5。Sox10型,奥利格2、和Nkx6.2个足以将成纤维细胞重新编程为iOPC
a、，量化第21天原始8TF池子集诱导的Plp1:eGFP+细胞百分比的总结图（n=3个来自1批慢病毒的独立生物复制；代表性流式细胞仪图见补充图4）。一个3TF的池Sox10、Olig2、，和Nkx6.2个显示了从MEF中诱导Plp1:eGFP+细胞的强大能力（20.8%+/-1.5%）。使用双尾Student t检验比较各组之间的差异（**p<0.02和*p<0.05，而8TFs+Dox）。b、 c、，免疫荧光(b条)和量化(c（c）)数据显示第21天3TF诱导的MEF（3TF+Dox）对分化信号（3TFs+Dox分化）作出反应并生成多处理O4+少突胶质细胞的能力。注意，未分化培养物（3TFs+Dox）含有大量O4+细胞，这些细胞大多是双极的。3TF未诱导的MEFs（3TFs−Dox分化）和未感染诱导的MEFs（无TFs+Dox分化）未产生O4+细胞。从三个重复的微孔中手动对O4+细胞进行评分，数据表示为平均值±S.E.M.（n=1批慢病毒的3个独立生物复制品）。d日，代表性免疫荧光图像显示了3TF诱导的MEF（3TF+Dox）在暴露于三种不同谱系诱导条件下的分化潜能。在多西环素存在（+Dox）或不存在（−Dox）的情况下，3TF诱导的MEF在3天内分化为表达MBP的iOL。当暴露于相应的神经元或星形胶质细胞促进培养条件下时，3TF诱导的MEF在存在（+Dox）或不存在（−Dox）多西环素的情况下，均不会产生神经元（MAP2）或星形细胞（GFAP）。同时染色以确保每个抗体功能的阳性对照细胞类型：多能干细胞衍生少突胶质细胞（MBP）、星形胶质细胞（GFAP）和神经元（MAP2）。e、，当暴露于少突胶质细胞分化条件下3天时，3TF诱导的MEF（3TF+Dox）分化为MBP+少突胶质上皮细胞的定量效率。数据以每4×10 MBP+iOL的平均值±S.E.M.表示4接种细胞（n=10个来自3批慢病毒的独立生物复制品）。以高病毒滴度产生的3TF+Dox细胞显示出产生MBP+iOL的效率平行增加（3TF+Dox高病毒滴率；n=8个来自2批慢病毒的独立生物复制品）。（f），第21天3TF诱导的MEF移植到冠状前脑切片培养10天后产生的多层致密髓鞘的电子显微图像颤抖者突变小鼠。克，植入Plp1的免疫荧光图像和形态：eGFP+3TF诱导的MEF移植到P5冠状前脑切片培养10天后颤抖者突变小鼠。小时从3TF诱导的MEF移植到颤抖者前脑切片（0.63±0.09）。组与野生型之间的差异（所示为与图3n相同的对照样品：野生型（0.69±0.07），颤抖者（0.88±0.05）和8TF诱导的MEF移植到颤抖器使用双尾Student t检验（***p<2.2×10）比较前脑切片和脊髓背侧（0.69±0.07）−16野生型vs。颤抖者.所有其他不重要）。。标尺，25μm(b条,d日)，100微米(克)和100nm(（f）).
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参考文献

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