The novel actin/focal adhesion-associated protein MISP is involved in mitotic spindle positioning in human cells

doi:10.4161/cc.24602

.2013年5月1日；12(9):1457-71.

doi:10.4161/cc.24602。 Epub 2013年4月10日。

新的肌动蛋白/局灶黏附相关蛋白MISP参与人类细胞有丝分裂纺锤体定位

贝蒂娜·梅尔¹, 正式任命柯实迈先生, 西蒙·安德胡布, 汉斯沃尔特·曾格拉夫, 阿尔文·克雷默

附属公司

PMID： 23574715
预防性维修识别码： PMC3674073型
内政部： 10.4161/cc.24602

新的肌动蛋白/局灶黏附相关蛋白MISP参与人类细胞有丝分裂纺锤体定位

贝蒂娜·梅尔等。细胞周期. 2013.

.2013年5月1日；12(9):1457-71.

doi:10.441/cc.24602。 Epub 2013年4月10日。

作者

贝蒂娜·梅尔¹, 正式任命柯实迈先生, 西蒙·安德胡布, 汉斯沃尔特·曾格拉夫, 阿尔文·克雷默

附属

¹德国海德堡大学德国癌症研究中心和内科五系分子血液学/肿瘤学临床合作单位。

PMID： 23574715
预防性维修识别码： PMC3674073型
内政部： 10.4161/cc.24602

摘要

精确的有丝分裂纺锤体定位对于调节细胞命运选择、细胞大小和组织内细胞位置至关重要。纺锤定位最突出的模型涉及皮层拉动机制，其中负向微管运动蛋白动力蛋白附着在细胞皮层上，并对到达皮层的星形微管正端施加拉力。在非极化培养的整合素依赖细胞中，收缩纤维介导的细胞粘附参与纺锤取向。作为皮质肌动蛋白或收缩纤维与星状微管之间的中介物的蛋白质在很大程度上仍然未知。在最近的全基因组RNAi筛查中，我们发现一种以前没有特征化的蛋白MISP（C19ORF21）参与中心体聚集，这一过程通过微管张力将癌细胞中多余的中心体聚集成双极有丝分裂纺锤体阵列。这里，我们表明MISP和肌动蛋白细胞骨架和局部粘连相关，并且仅在粘附细胞类型中表达。在有丝分裂过程中，MISP被Cdk1磷酸化并定位于回缩纤维。MISP与+TIP EB1和p150（粘附）相互作用，p150是动力蛋白/动力蛋白复合物的一个亚单位。MISP的耗竭会导致有丝分裂阻滞，姐妹动粒间的张力降低，染色体错位和多中心体癌细胞的纺锤体多极性。纺锤体取向分析表明，MISP缺失导致有丝分裂纺锤体相对于细胞轴和细胞中心的位置随机化。总之，我们认为MISP将微管连接到肌动蛋白细胞骨架和局部粘连，以便正确定位有丝分裂纺锤体。

关键词：MISP；肌动蛋白；细胞粘附；中心体聚集；中心体；焦点粘附；有丝分裂；主轴定向；主轴定位。

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数字

**图1。**中心体聚类需要MISP(A类)MISP的耗尽导致UPCI:SCC114细胞中多极有丝分裂纺锤体的形成。用荧光素酶或MISP-1-siRNA处理细胞48小时，并用α-微管蛋白抗体进行免疫染色。比例尺，10µm。(B)siRNA-介导的MISP缺失仅在含有多余中心体的细胞（UPCI:SCC114、MDA-MB-231、DU145）中导致多极有丝分裂纺锤体，而在含有规则中心体内容物的细胞（DLD-1、U2OS或hTERT-RPE1）中没有。用荧光素酶或MISP-1-siRNA处理细胞48小时，并用α-微管蛋白抗体进行免疫染色。图表显示了三个独立实验的平均值；平均值±标准差(C类)UPCI中MISP的耗竭：组成性表达GFP-α-微管蛋白的SCC114细胞导致纺锤体多极性，每个纺锤体极上有两个中心粒。用荧光素酶或MISP-1-siRNA转染细胞48小时，然后用5µm的定心蛋白抗体进行免疫染色。(D类)两种不同siRNAs对MISP的耗尽导致UPCI:SCC114细胞的有丝分裂阻滞。在siRNA转染48小时后，用α-微管蛋白抗体进行免疫染色，然后对有丝分裂指数进行评分。图表显示了三个独立实验的平均值；平均值±SD(E类)MISP耗竭导致UPCI:SCC114细胞纺锤体张力丧失。用荧光素酶或MISP-1-siRNA转染细胞48小时后，用BubR1和α-微管蛋白抗体对细胞进行免疫染色。比例尺，10µm。(F类)在UPCI:SC114细胞的双极有丝分裂纺锤体中，MISP的消耗导致动粒间距离显著缩短。在转染指示的siRNAs 48小时后，测量粒间距离。用Hec-1和Crest抗体对细胞进行联合免疫染色。荧光素酶特异性siRNA作为对照。图表显示了三个独立实验的平均值；平均值±标准偏差。

**图2。**MISP抗体可检测内源性和过表达的GFP-MISP。(A类)针对MISP C末端的小鼠单克隆MISP抗体（克隆C118，左侧面板）检测到UPCI:SCC114细胞中75 kDa的带，该细胞转染了抗荧光素酶的siRNA。转染MISP特异性siRNAs（1-3）48小时可降低MISP信号。GAPDH用作装载控制。针对蛋白N末端的单克隆MISP抗体（克隆N14，右面板）检测到UPCI:SCC114细胞中的75kDa带，该细胞转染了抗荧光素酶的siRNA。转染MISP特异性siRNAs（1-3）48小时后，使用该抗体再次降低MISP信号。GAPDH起到了装载控制的作用。(B)用两种MISP抗体（C118和N14）免疫染色检测UPCI中明显减少的纤维状结构：与转染荧光素酶siRNA的细胞相比，转染MISP特异性siRNA（MISP-1、MISP-2、MISP-3）48小时的SCC114细胞。细胞边界用白线表示。比例尺，10µm。(C类)添加强力霉素24小时后，GFP-MISP-U2OS细胞中的GFP-MISP抗体C118（左面板）和N14（中面板）以及GFP-MISPA抗体（右面板）可以检测到GFP-MISAP。GAPDH用作装载控制。

**图3。**MISP定位于肌动蛋白和局部粘连，仅在粘连细胞类型中表达。(A类)指数增长的UPCI:SCC114细胞与MISP（C118）和Phalloidin-TRITC（上部面板）的抗体共免疫，显示MISP与肌动蛋白细胞骨架的部分共定位。MISP与局灶黏附标记物paxillin（中面板）和自磷酸化局灶黏着激酶（FAK Y397，下面板）的共同免疫抑制显示，纤维状MISP结构通常以局灶黏结结束。白色矩形标记放大插图的位置。比例尺，10µm；嵌入2µm。(B)GFP-MISP在GFP-MISP-U2OS细胞中显示出与Phalloidin TRITC的显著共定位（上图）。用局灶性黏附标记物paxillin（中面板）和FAK Y397（下面板）进行免疫染色显示，GFP-MISP纤维也以局灶性粘连结束。通过添加强力霉素48小时诱导GFP-MISP的表达。白色矩形标记放大插入物的位置。比例尺，10µm；嵌入2µm。(C类)免疫印迹显示使用MISP抗体（C118）的各种粘附癌（左上面板）、非转化癌（右上面板）以及非粘附癌（右下面板）和非转化细胞系中MISP的表达水平。UPCI:SCC114细胞裂解物作为阳性对照。肌动蛋白和GAPDH用作加载控制。

**图4。**MISP在有丝分裂期间被磷酸化。(A类)UPCI的免疫印迹：SCC114细胞通过双胸苷阻断同步并释放长达24小时，显示G₂/细胞周期的M期（释放后8-12小时）。细胞周期蛋白B1的表达用于监测细胞周期进展。肌动蛋白充当加载控制。加载UPCI:SCC114异步生长细胞（as）的裂解液进行比较。(B)MISP（0 h）的有丝分裂修饰在诺康唑阻止有丝分裂的UPCI:SCC114细胞中更为明显。细胞周期蛋白E用于监测有丝分裂细胞震荡后（0–9小时）的细胞周期进展，并在无诺克唑的培养基中进行替换。肌动蛋白充当加载控制。(C类)异步（−nocodazole）和有丝分裂（+nocodazoli）UPCI:SCC114细胞在λ-磷酸酶缺失（−磷酸酶）或存在（+磷酸酶）的情况下裂解，表明MISP在有丝分裂期间磷酸化。(D类)通过GFP陷阱从组成性表达GFP的GFP-MISP-U2OS细胞或U2OS细胞（右图）中分离GFP-MISP或GFP，与重组Cdk1/细胞周期蛋白B和[γ-³²P] -ATP并通过放射自显影术进行分析（左侧面板）。

**图5。**MISP与FAK相互作用并定位于有丝分裂收缩纤维。(A类)GFP陷阱的免疫印迹显示FAK与GFP-MISP（结合，GFP-trap）共沉淀，但与对照珠（结合，对照陷阱）不共沉淀。(B)共免疫沉淀（IP）表明内源性MISP与FAK（结合）共沉淀，而在对照IP的结合部分中未检测到MISP。(C类)用MISP（C118）和α-微管蛋白抗体共同免疫显示，MISP存在于有丝分裂UPCI:SCC114细胞的收缩纤维中。白色矩形标记放大插图的位置。比例尺，10µm；嵌入2µm。(D类)在胞质分裂期间重新附着的UPCI:SCC114细胞中，MISP定位于细胞皮层的膜突起。白色矩形标记放大插图的位置。比例尺，10µm；嵌入2µm。

**图6。**MISP参与定向细胞迁移和中心体重新定向。(A类)创伤愈合试验中UPCI:SCC114细胞的活细胞视频显微镜显示，与转染抗荧光素酶siRNA的细胞相比，MISP缺失的细胞闭合伤口间隙的速度较慢。用荧光素酶或MISP-1 siRNA转染细胞24小时，然后成像。每30分钟拍摄一次图像。比例尺，100µm。(B)UPCI中相对细胞边界之间距离的测定：转染24至42小时后用抗荧光素酶或MISP的siRNAs转染的SCC114细胞。图表显示了两个独立实验的平均值。(C类)UPCI中心体抗体的免疫染色：SCC114细胞被迫向指定方向迁移，显示MISP缺失后中心体定位于细胞核朝向迁移方向一侧的缺陷。用指示的siRNAs转染细胞48小时。固定前2小时设置刮痕。白线表示刮痕。比例尺，10µm。(D类)显示UPCI中心体相对于伤口边缘位置的图表：SCC114细胞被迫向指定方向迁移，显示中心体位于细胞核面向伤口边缘一侧（朝向）的细胞频率降低，中心体处于（中部）的细胞百分比增加MISP耗竭48小时后，或在核后面（远离）。该图显示了三个独立实验的平均值；平均值±标准偏差。

**图7。**MISP涉及主轴定向和定位。(A类)有丝分裂UPCI的典型例子：用抗荧光素酶siRNA（左）或MISP（右）在L型纤维连接蛋白微模式上转染SCC114细胞48小时，用抗中心蛋白（红色）和α-微管蛋白（绿色）抗体染色；DNA（Hoechst 33342）显示为蓝色。荧光素酶-siRNA转染的细胞沿着L型微模式的斜边定向其有丝分裂纺锤体。相反，在MISP-1-siRNA转染的细胞中，纺锤体方向偏离了这个方向。比例尺，5µm。(B)用荧光素酶或MISP的siRNA处理的细胞的纺锤体取向偏离L形微图案斜边的角度偏差的频率。该图表示三个独立实验中评估的所有有丝分裂细胞的总和。(C类)UPCI的代表性图像（上面板）：用指示的siRNAs转染SCC114细胞48小时，并用pan-cadherin抗体染色以标记细胞边界和α-微管蛋白，显示MISP缺失细胞中的有丝分裂纺锤体位于细胞中心外。白线表示单元边界。比例尺，10µm。下图显示了转染指示的siRNA后，有丝分裂纺锤体相对于细胞中心的位置分布图。该图表示在三个独立实验中评估的有丝分裂细胞总数。(D类)转染有指示siRNAs的GFP-MISP-U2OS细胞的代表性图像（上面板），用α-微管蛋白抗体和Hoechst 33342染色。当MISP被siRNAs MISP-1和MISP-2耗竭时，有丝分裂纺锤体从细胞中心移位，这两种siRNA均耗竭内源性和过度表达的GFP-MISP。在转染MISP-3-siRNA的细胞中，仅内源性MISP有丝分裂纺锤体位于细胞中心。在siRNA转染24小时后再继续24小时诱导GFP-MISP的表达。白线显示细胞边界。比例尺，10µm。纺锤体位置的测定（下面板）表明，转染siRNAs MISP-1和MISP-2的细胞中的有丝分裂纺锤体从细胞中心移位，而GFP-MISP的过度表达将纺锤体定位到细胞中心。该图显示了三个独立实验中评估的有丝分裂细胞总数。

**图8。**MISP对纺锤定位和染色体比对的影响。(A类)GFP-α-微管蛋白表达的UPCI:SCC114细胞的代表性z-stack图像（Z1、Z2、Z3彼此相隔1µm），用抗pericentrin抗体（红色）和Hoechst 33342抗体（蓝色）进行免疫染色。虽然荧光素酶-siRNA转染细胞的中心体定位于同一焦平面，但MISP缺失细胞的中心体位于不同焦平面。用指示的siRNA转染细胞48小时。比例尺，10µm。(B)显示了基板平面和主轴之间夹角的频率分布。该图描绘了在三个独立实验中评估的有丝分裂细胞的总和。使用反三角函数确定角度。(C类)通过Hoechst 33342对UPCI进行DNA染色：转染荧光素酶siRNA或MISP-siRNA 48小时的SCC114细胞显示出在MISP缺失细胞的中期板上没有对齐的染色体。比例尺，10µm。(D类)UPCI:SCC114细胞在转染指定的siRNA 48小时后染色体排列缺陷的量化。图表显示了三个独立实验的平均值；平均值±标准偏差。

**图9。**MISP与p150相互作用^胶合的和EB1。(A类)共免疫沉淀的免疫印迹显示EB1与MISP（MISP-IP，结合）共沉淀。(B)GFP-MISP-U2OS细胞GFP-trap的免疫印迹显示GFP-MISP与p150的弱相互作用^胶合的（GFP-trap，绑定）。(C类)共免疫沉淀证明内源性MISP与p150共沉淀^胶合的（第150页^胶合的-IP，绑定）。(D类)UPCI的联合免疫抑制：SCC114细胞在转染所示siRNA 48小时后，具有MISP（C118，绿色）和高尔基成分GM130（红色，上面板）或α-微管蛋白（绿色）和GM130（红，下面板）抗体，表明高尔基复合体分散在MISP缺失的细胞中。单元格边界用白线表示。比例尺，10µm。

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中的注释

MISP：细胞外基质和星形微管之间缺失的联系。
Nain AS、Cimini D。 Nain AS等人。细胞周期。2013年6月15日；12(12):1821-2. doi:10.4161/cc.25171。Epub 2013年5月30日。细胞周期。2013 PMID：23759569 免费PMC文章。没有可用的摘要。

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