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.2013年6月25日；110(26):10646-51.
doi:10.1073/pnas.1220921110。 Epub 2013年3月18日。

支架蛋白SPIDR/KIAA0146连接布鲁姆综合征解旋酶与同源重组修复

李婉 1, 金华汉族, 刘婷（Ting Liu）, 董顺利, 冯燮, 陈红霞, 黄军（Jun Huang）
附属公司

支架蛋白SPIDR/KIAA0146连接布鲁姆综合征解旋酶与同源重组修复

李婉等。 美国国家科学院程序. .

摘要

布鲁姆综合征基因产物BLM是高度保守的RecQ家族成员。一个新兴的概念是BLM解旋酶与同源重组（HR）机制协作，以帮助避免不良的HR事件，并在HR反应期间实现高度的保真度。然而，这种协调在体内是如何发生的尚不清楚。在这里，我们确定了一种称为SPIDR（参与DNA修复的支架蛋白）的蛋白质，作为BLM和HR机制之间的联系。SPIDR独立地与BLM和RAD51相互作用，并促进形成具有生物重要性的BLM/RAD51复合物。与其作为组装BLM和RAD51病灶的支架蛋白的作用一致，缺乏SPIDR的细胞显示姐妹染色单体交换率增加和HR缺陷。此外，SPIDR缺乏导致基因组不稳定，并导致对DNA损伤剂的超敏反应。我们建议，通过在多功能DNA处理复合体中为BLM和RAD51的合作提供一个支架，SPIDR不仅调节HR的效率，还指示特定的HR途径。

关键词：DNA双链断裂；双霍利迪结；不交叉。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
将SPIDR标识为BLM-binding合作伙伴。(A类和B类)293T细胞稳定表达SFB标记的BLM或SPIDR，用于蛋白复合物的TAP。表格是通过质谱分析鉴定的蛋白质的摘要。粗体字母表示诱饵蛋白质。(C类)将编码SFB标记BLM或Morc3的质粒与编码Myc-tagged SPIDR的质粒瞬时转染293T细胞。如图所示，进行共沉淀和免疫印迹。(D类和E类)SiRNA处理的HeLa细胞在苯甲酸酶的存在下进行裂解，然后将细胞裂解物与蛋白A琼脂糖珠（与指示抗体结合）孵育，并按指示进行Western blot分析。(F类)杆状病毒感染昆虫细胞纯化的重组GST-BLM与体外翻译SPIDR（IVT-SPIDR）之间的直接结合。(上部)免疫印迹法检测SPIDR。(下部)输入考马斯染色显示的GST蛋白。(G公司)SPIDR与BLM共同定位。SFB标记的SPIDR在HeLa细胞中表达。（放大倍数：100×。）分别用抗Flag和抗BLM抗体的免疫荧光法检测该融合蛋白和BLM在HU（2 mM）暴露16 h或CPT（1μM）暴露3 h后组装的Foci。合并后的图像显示同位化。
图2。
图2。
SPIDR是BLM病灶形成和抑制SCE所必需的。(A类)定量RT-PCR显示SPIDR mRNA水平被siRNA下调。条形图表示三个实验的平均值，误差条形图表示SD。(B类)转染有指示siRNA的细胞的代表性免疫印迹。(C类和D类)BLM病灶形成需要SPIDR。用对照siRNA或SPIDR或BLM特异性siRNA转染U2OS细胞两次。转染后48小时，用HU（2 mM）处理细胞16小时或CPT（1μM）处理3小时，然后固定并处理BLM和γH2AX免疫荧光。显示了具有代表性的BLM病灶（HU治疗）(C类). （放大倍数：100×。）量化结果是三个独立实验的平均值，以平均值±SEM表示(D类). (E–G公司)通过表达siRNA#1抗性SPIDR cDNA拯救BLM病灶形成。在四环素诱导启动子的控制下，产生了一个表达siRNA#1抗性SPIDR（SFB-SPIDR-SiR）的U2OS细胞系。在HU（2 mM）或CPT（1μM）治疗之前，将产生的细胞系转染有指示的siRNAs，并保持未诱导（−）或通过添加多西环素（Dox）诱导（+）24小时。HU处理16h或CPT处理3h后，固定细胞并进行BLM免疫荧光处理。用抗Flag抗体免疫印迹法证实外源性SPIDR的表达(E类). 显示了具有代表性的BLM病灶（HU治疗）(F类). （放大倍数：100×。）量化结果是三个独立实验的平均值，以平均值±SEM表示(G公司). (H（H）)SPIDR抑制SCE。具有代表性的中期扩散显示来自转染对照或SPIDR siRNA的HeLa细胞的SCE（红色箭头）。（放大倍数：100×。）
图3。
图3。
SPIDR促进同源重组。(A类和B类)RAD51病灶的形成需要SPIDR。U2OS细胞在固定前用IR（10Gy）或CPT（1μM）处理3h，并进行RAD51和γH2AX免疫荧光处理。显示了具有代表性的RAD51焦点（红外处理）(A类). （放大倍数：100×。）量化结果是三个独立实验的平均值，以平均值±SEM表示(B类). (C类)HR分析示意图。(D类)用指示的siRNA转染U2OS DR-GFP细胞，24小时后用I-SceI表达质粒电穿孔。电穿孔48小时后，收集细胞并通过FACS分析检测GFP的表达。结果是三个独立实验的平均值，表示为平均值±SEM(E类). 通过免疫印迹法确认敲除效率。(F类和G公司)通过表达siRNA#1抗性SPIDR cDNA拯救RAD51病灶的形成。如图2所示进行免疫染色实验F类.显示了具有代表性的RAD51焦点（红外处理）(F类). （放大倍数：100×。）量化结果是三个独立实验的平均值，以平均值±SEM表示(G公司). (H（H）)免疫印迹证实外源性SPIDR表达。
图4。
图4。
SPIDR和RAD51之间的功能交互。(A类)将编码SFB标记RAD51或Morc3的质粒与编码Myc-tagged SPIDR的质粒一起转染293T细胞。如图所示，进行共沉淀和免疫印迹。(B类)从细菌中纯化的重组GST-RAD51和在体外翻译的SPIDR中的直接结合。(上部)免疫印迹法检测SPIDR。(下部)输入考马斯染色显示的GST蛋白。(C类和D类)SiRNA处理的HeLa细胞在苯甲酸酶的存在下进行裂解，然后将细胞裂解物与蛋白A琼脂糖珠与指示抗体结合，并按指示进行Western blot分析。
图5。
图5。
SPIDR是维持基因组完整性所必需的。(A类)内源性SPIDR、BLM和RAD51存在于三聚体复合体中。HeLa萃取物通过凝胶过滤分离，并且通过免疫印迹分析其组分(左侧). 用SPIDR、BLM和RAD51特异性抗体通过免疫印迹分析含有SPIDR、BLM和RAD51的组分的抗SPIDR、抗BLM和抗RAD51免疫沉淀(赖特). (B类)用抗BLM抗体对转染对照或SPIDR siRNA的HeLa细胞进行共免疫沉淀。如图所示，使用抗体进行免疫印迹。(C类)用所示siRNAs处理的HeLa细胞制备的中期扩散的代表性图像。典型的畸变用箭头标记。（放大倍数：100×。）(D类)对照组和SPIDR缺失HeLa细胞染色体畸变的量化。显示了两个实验的平均值；每个实验至少计数50个细胞。误差条代表SD(E–G公司)IR、CPT或MMS处理后SPIDR缺失HeLa细胞的克隆形成存活分析。实验分三次进行。结果显示为三个独立实验的平均值。(H（H）)提出了一种SPIDR在DNA修复中的功能模型。
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