Cellular localization and trafficking of vascular adhesion protein-1 as revealed by an N-terminal GFP fusion protein

doi:10.1007/s00702-013-1003-3

.2013年6月；120(6):951-61.

doi:10.1007/s00702-013-1003-3。 Epub 2013年3月9日。

N-末端GFP融合蛋白揭示的血管黏附蛋白-1的细胞定位和转运

克里斯·韦斯顿¹, 艾玛·L·谢泼德, 大卫·H·亚当斯

附属公司

PMID： 23474851
预防性维修识别码：项目经理3664183
内政部： 2007年10月7日/00702-013-1003-3

N-末端GFP融合蛋白揭示的血管黏附蛋白-1的细胞定位和转运

克里斯·韦斯顿等。神经传输杂志（维也纳）. 2013年6月.

.2013年6月；120(6):951-61.

doi:10.1007/s00702-013-1003-3。 Epub 2013年3月9日。

作者

克里斯·韦斯顿¹, 艾玛·L·谢泼德, 大卫·H·亚当斯

附属

¹伯明翰大学医学和牙科学院MRC免疫调节中心生物医学研究所肝脏研究中心和NIHR生物医学研究室，英国伯明翰Edgbaston，B15 2TT。c.j.weston@bham.ac.uk

PMID： 23474851
预防性维修识别码：项目经理3664183
内政部： 2007年10月10日至2007年2月13日至2003年3日

摘要

最近对血管黏附蛋白-1（VAP-1）的研究极大地提高了我们对该蛋白在炎症疾病的建立和进展中所起的重要作用的认识。为了便于对VAP-1的功能进行更详细的研究，我们开发了一种GFP融合蛋白，使我们能够监测三种选定细胞类型中该蛋白的转运：肝窦内皮细胞、肝肌成纤维细胞和肝星状细胞系（LX-2）。融合蛋白被检测为点状细胞质GFP染色，但在所有研究的细胞类型中仅在细胞表面低水平存在。蛋白质的亚细胞分布在蛋白的催化失活突变形式（Tyr471Phe）或存在外源VAP-1底物（甲胺）或抑制剂（氨基脲）时未发生改变。GFP-VAP-1蛋白定位于高尔基体（GM-130）、内质网（GRP94）和早期内体（EEA-1）。VAP-1的进一步染色显示，GFP荧光信号阴性且不表达EEA-1的囊泡中也存在过表达蛋白。我们认为，这些囊泡负责回收融合蛋白，并且GFP部分的荧光在这些囊泡内的低pH值下熄灭。蛋白质的这一特性使其非常适合于活细胞成像研究，在活细胞成像中，我们希望跟踪细胞内积极运输的蛋白质，而不是正在回收的蛋白质。

PubMed免责声明

数字

图1
HEK293中表达的GFP-wtVAP-1融合蛋白具有酶活性一通过western blot（检测：抗VAP-1 TK8-14 mAb）评估，在HEK293中表达的GFP-wtVAP-1和酶死亡突变体GFP-（Y471F）VAP-1的分子量约为115 kDa（预测为113 kDa）。由于GFP部分的存在，这大于重组VAP-1（rVAP-1，对应VAP-1的胞外结构域）的分子量。GFP-CAT转染细胞中未检测到VAP-1。b条通过Amplex红试验评估，HEK293中表达的GFP-wtVAP-1能够脱除人工底物苄胺。酶切突变体GFP-（Y471F）VAP-1、控制蛋白GFP-CAT和C末端GFP融合蛋白wtVAP-1-GFP的基础活性很低(****第页 < 0.001与GFP-wtVAP-1，Tukey后验的单向方差分析，Graphpad Prism v.6.0a）

图2
GFP-VAP-1融合蛋白定位于内皮细胞、成纤维细胞和肝星状细胞系中的囊泡一GFP-CAT公司(*顶部面板*)和GFP-wtVAP-1(*下部面板*)用多色共焦显微镜观察LX-2、aLMF和HSEC瞬时转染产生的融合蛋白。DAPI染色的细胞核如图所示蓝色.比例尺20微米b条使用抗VAP-1抗体TK8-14在LX-2、aLMF和HSEC的细胞裂解液中检测到二聚GFP-wtVAP-1。aLMF和HSEC的样品以8μg/车道加载，LX-2以40μg/通道加载

图3
GFP-wtVAP-1定位于内体和其他细胞囊泡。一多色共聚焦显微镜显示GFP-wtVAP-1与早期内体标记物EEA-1共定位。合并图像：GFP绿色; EEA-1型红色; VAP-1型蓝色; 核白色.b条GFP和抗VAP-1抗体荧光在活细胞和固定细胞中的分布表明细胞内存在GFP^低的VAP-1型^高的固定细胞中的小泡，但不是活细胞中的。合并图像：GFP绿色; VAP-1型红色; 核蓝色.比例尺20微米

图3
GFP-wtVAP-1定位于内体和其他细胞囊泡。一多色共聚焦显微镜显示GFP-wtVAP-1与早期内体标记物EEA-1共定位。合并图像：GFP绿色; 欧洲经济区-1红色; VAP-1型蓝色; 核白色.b条GFP和抗VAP-1抗体荧光在活细胞和固定细胞中的分布表明细胞内存在GFP^低的VAP-1型^高的固定细胞中的小泡，但不是活细胞中的。合并图像：GFP绿色; VAP-1型红色; 核蓝色.比例尺20微米

图4
用巴非霉素处理细胞，并对LAMP-1进行染色，结果显示GFP-wtVAP-1定位于低浓度第页H（H）一在巴非霉素A1（1μM）存在下，与溶媒处理的对照组相比，来自GFP-wtVAP-1的GFP和VAP-1信号显示出更大的共定位。GFP-CAT转染细胞中GFP信号的分布没有差异（数据未显示）。合并图像：GFP绿色; VAP-1型红色; 核蓝色.b条溶酶体相关膜蛋白-1（LAMP-1）与抗VAP-1染色在载体和巴非霉素A1处理的HSEC中共同定位，而与GFP信号的重叠仅见于巴非霉素A1处理的细胞。合并图像：GFP/VAP-1绿色; 灯-1红色; 核蓝色.c（c）细胞松弛素D（10μM）是肌动蛋白细胞骨架的破坏者，它改变了VAP-1的分布，在HSEC中观察到的影响最大。*比例尺*20微米

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1. Airenne TT、Nymalm Y、Kidron H、Smith DJ、Pihlavisto M、Salmi M、Jalkanen S、Johnson MS、Salminen TA。人类血管粘附蛋白-1的晶体结构：具有功能意义的独特结构特征。蛋白质科学。2005;14(8):1964–1974. doi:10.1110/ps.051438105。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
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1. Jalkanen S、Karikoski M、Mercier N、Koskinen K、Henttinen T、Elima K、Salmivirta K、Salli M。血管粘附蛋白-1（VAP-1）的氧化酶活性诱导内皮E-和P-选择素以及白细胞结合。鲜血。2007;110(6):1864–1870. doi:10.1182/bloud-2007-01-069674。-内政部-公共医学
1. Koskinen K、Vainio PJ、Smith DJ、Pihlavisto M、Yla-Herttuala S、Jalkanen S、Salmi M。通过内皮细胞的粒细胞迁移受血管粘附蛋白-1（VAP-1）血液的氧化酶活性调节。2004;103(9):3388–3395. doi:10.1182/bloud-2003-09-3275。-内政部-公共医学

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[1] Airenne TT、Nymalm Y、Kidron H、Smith DJ、Pihlavisto M、Salmi M、Jalkanen S、Johnson MS、Salminen TA。人类血管粘附蛋白-1的晶体结构：具有功能意义的独特结构特征。蛋白质科学。2005;14(8):1964–1974. doi:10.1110/ps.051438105。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[2] Airenne TT、Nymalm Y、Kidron H、Smith DJ、Pihlavisto M、Salmi M、Jalkanen S、Johnson MS、Salminen TA。人类血管粘附蛋白-1的晶体结构：具有功能意义的独特结构特征。蛋白质科学。2005;14(8):1964–1974. doi:10.1110/ps.051438105。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[3] Bowman EJ、Siebers A、Altendorf K.Bafilomycins：一类来自微生物、动物细胞和植物细胞的膜ATP酶抑制剂。美国国家科学院院刊1988；85(21):7972–7976. doi:10.1073/pnas.85.21.7972。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[4] Bowman EJ、Siebers A、Altendorf K.Bafilomycins：一类来自微生物、动物细胞和植物细胞的膜ATP酶抑制剂。美国国家科学院院刊1988；85(21):7972–7976. doi:10.1073/pnas.85.21.7972。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[5] Holt AP、Haughton EL、Lalor PF、Filer A、Buckley CD、Adams DH。肝肌成纤维细胞调节人肝淋巴细胞的浸润和定位。胃肠病学。2009;136(2):705–714. doi:10.1053/j.gastro.2008.10.020。-内政部-公共医学

[6] Holt AP、Haughton EL、Lalor PF、Filer A、Buckley CD、Adams DH。肝肌成纤维细胞调节人肝淋巴细胞的浸润和定位。胃肠病学。2009;136(2):705–714. doi:10.1053/j.gastro.2008.10.020。-内政部-公共医学

[7] Jalkanen S、Karikoski M、Mercier N、Koskinen K、Henttinen T、Elima K、Salmivirta K、Salli M。血管粘附蛋白-1（VAP-1）的氧化酶活性诱导内皮E-和P-选择素以及白细胞结合。鲜血。2007;110(6):1864–1870. doi:10.1182/bloud-2007-01-069674。-内政部-公共医学

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[9] Koskinen K、Vainio PJ、Smith DJ、Pihlavisto M、Yla-Herttuala S、Jalkanen S、Salmi M。通过内皮细胞的粒细胞迁移受血管粘附蛋白-1（VAP-1）血液的氧化酶活性调节。2004;103(9):3388–3395. doi:10.1182/bloud-2003-09-3275。-内政部-公共医学

[10] Koskinen K、Vainio PJ、Smith DJ、Pihlavisto M、Yla-Herttuala S、Jalkanen S、Salmi M。通过内皮细胞的粒细胞迁移受血管粘附蛋白-1（VAP-1）血液的氧化酶活性调节。2004;103(9):3388–3395. doi:10.1182/bloud-2003-09-3275。-内政部-公共医学

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