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.2013年4月；33(8):1621-31.
doi:10.128/MCB.01342-12。 Epub 2013年2月11日。

DCNL1作为cullin 2-RING连接酶的底物传感器和激活剂发挥作用

帕迪普继承人 1, 罗克萨娜·苏凡, 萨曼莎·格里尔, 贝蒂·潘恩, 杰弗里·E·李, 迈克尔噢
附属公司

DCNL1作为cullin 2-RING连接酶的底物传感器和激活剂发挥作用

帕迪普继承人等。 分子细胞生物学. 2013年4月.

摘要

F-box蛋白与底物的结合促进了cullins的NEDD8修饰，这是激活cullin-RING E3泛素连接酶（CRL）所必需的。然而，底物募集触发cullin neddylation的机制尚不清楚。在这里，我们将DCNL1（cullin nedylation 1-样1缺陷）鉴定为CRL2的一种称为ECV的成分（elongins BC/CUL2/VHL），并表明DCNL1的分子抑制减弱了CUL2的nedylation。DCNL1通过其DAD补丁与CUL2结合，但也能够独立于CUL2和DAD补丁结合VHL。底物低氧诱导因子1α（HIF1α）与底物受体VHL的结合增加了DCNL1与VHL以及CUL2的结合。值得注意的是，HIF1α的一种工程突变形式与CUL2结合，但与DCNL1不结合，不能触发CUL2烯二基化，并将ECV保持在非活性状态。这些发现支持一种模型，即底物参与促进DCNL1招募，促进CUL2 neddylation的启动，并将DCNL1定义为ECV激活的“底物传感器开关”。

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数字

图1
图1
HIFα亚型促进CUL2奈德化。用10μM MG132蛋白酶体抑制剂处理瞬时转染有所示质粒的HEK293细胞并进行裂解。用所示抗体免疫沉淀等量的蛋白裂解物，用SDS-PAGE溶解，并用所示的抗体免疫印迹。WCE，全细胞提取物；IP，免疫沉淀。
图2
图2
DCNL1促进CUL2的NEDD8修饰。（A） 用越来越多的DCNL1-FLAG瞬时转染U2OS细胞。在转染后48小时，细胞被裂解，并使用SDS-PAGE溶解等量的蛋白质。用所示抗体通过免疫印迹法检测分离的蛋白质。用所示质粒瞬时转染（B至E）HEK293细胞。在转染后48小时，用所示抗体进行免疫沉淀和免疫印迹。（F） 使用抗DCNL1或IgG对照抗体免疫沉淀HEK293、U2OS或TF-1细胞裂解物，溶解并用指示的抗体免疫印迹。WCE，全细胞提取物；IP，免疫沉淀。
图3
图3
DCNL1与ECV复合体啮合。（A） 用10μM MG132处理PC3细胞4 h，裂解，并使用抗DCNL1或对照抗体进行免疫沉淀。结合蛋白通过SDS-PAGE进行解析，并用所示抗体进行免疫印迹。用所示质粒转染（B和C）HEK293细胞。在裂解前4小时，用MG132处理细胞。细胞在转染后48小时被裂解。使用所示抗体进行抗-FLAG免疫沉淀和免疫印迹。如有指示，细胞在裂解前添加MG132 4小时后立即保持缺氧状态。（D） 从VHL缺失或VHL重组细胞产生的S100提取物与所示纯化蛋白或兔网织红细胞裂解物孵育在体外-翻译蛋白质产品。进行抗HA免疫沉淀，通过SDS-PAGE解析结合蛋白，并通过免疫印迹检测。（E） 用HA-VHL或空质粒瞬时转染所示的HEK293稳定细胞系。用MG132处理细胞4h并裂解，进行抗HA免疫沉淀。结合蛋白通过SDS-PAGE进行解析，并通过免疫印迹进行检测。WCE，全细胞提取物；IP，免疫沉淀。
图4
图4
DCNL1调节HIF1α活性。（A） 用非靶向干扰siRNA（siSCR）或DCNL1靶向siRNA（siDCNL1）转染HEK293细胞。用SDS-PAGE溶解等量的蛋白裂解物，并用所示抗体进行免疫印迹检测。（B） 通过慢病毒介导的针对DCNL1的两种不同shRNA结构的感染，在指定的细胞背景中产生稳定的细胞系。用MG132处理细胞4h并裂解，用SDS-PAGE溶解等量的蛋白裂解物。通过免疫印迹法检测所示蛋白。（C） 在缺氧反应元件和Renilla荧光素酶对照物的控制下，用编码萤火虫荧光素酶的质粒瞬时转染所示的稳定细胞系。在进行双核糖核酸酶分析之前，用MG132处理细胞4小时。pGIPZ被任意设置为100，以表示正常HIF1α活性。误差线表示平均值的标准偏差。未成对的t吨进行检验以评估统计学意义。
图5
图5
DCNL1绑定到VHL不需要CUL2。用所示质粒转染（A、B和C）HEK293细胞。用MG132处理细胞4 h。细胞被裂解，用抗FLAG抗体免疫沉淀，用SDS-PAGE溶解，并用所示抗体免疫印迹。（D） 细菌纯化的GST或GST-DCNL1与细菌纯化的His-VHL（1-155）孵育。他的下拉动作（PD）是用镍琼脂糖完成的；然后通过SDS-PAGE对蛋白质进行解析，并使用针对GST和His的抗体进行免疫印迹检测。（E） 兔网织红细胞裂解物在体外翻译的HA-HIF1α和HA-VHL与细菌纯化的GST或GST-DCNL1孵育。使用谷胱甘肽-Sepharose进行GST下拉。蛋白质通过SDS-PAGE进行解析，并使用所示抗体进行免疫印迹。（F） HA-HIF1α是在体外用兔网织红细胞裂解物或小麦胚芽提取物转化，并与细菌纯化的GST或GST-DCNL1孵育。使用谷胱甘肽-Sepharose进行GST下拉，结合蛋白通过SDS-PAGE进行解析，并使用指示的抗体进行检测。WCE，全细胞提取物；IP，免疫沉淀。
图6
图6
DCNL1通过VHL被募集，以启动CUL2的奈迪基化和HIF1α的降解。（A） 所示蛋白质及其招募CUL2和DCNL1的能力的示意图。（B） 所示结构为在体外在兔网织红细胞裂解物中翻译，并与细菌纯化的GST或GST-DCCNL1一起孵育。使用谷胱甘肽-Sepharose进行GST下拉（PD），通过SDS-PAGE解析结合蛋白并使用指示的抗体进行检测。（C） 用所示质粒转染HEK293细胞。在转染后48小时收集细胞，并使用抗GAL4抗体进行免疫沉淀。蛋白质通过SDS-PAGE分离，并使用所示抗体进行免疫印迹。（D） 所示质粒为在体外翻译，以及在体外泛素化是在存在（+）或不存在（-）FLAG-泛素（FLAG-Ub）和从VHL-null或VHL-rebustructed细胞生成的S100提取物的情况下进行的。使用抗GAL4抗体对反应混合物进行免疫沉淀，使用SDS-PAGE进行解析，并使用指示的抗体进行免疫印迹。WCE，全细胞提取物；免疫沉淀；IB，免疫印迹。
图7
图7
HIF1α（555–575）肽促进VHL-DCNL1相互作用的能力降低。所示结构为在体外在兔网织红细胞裂解液中翻译并与细菌纯化的GST或GST-DCNL1孵育。GST下拉（PD）使用谷胱甘肽-Sepharose进行，结合蛋白通过SDS-PAGE进行解析，并使用指示的抗体进行检测。
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