Single-molecule sorting reveals how ubiquitylation affects substrate recognition and activities of FBH1 helicase

doi:10.1093/nar/gkt056

.2013年4月1日；41(6):3576-87.

doi:10.1093/nar/gkt056。 Epub 2013年2月7日。

单分子分选揭示泛素化如何影响FBH1解旋酶的底物识别和活性

Tokiha Masuda-Ozawa公司¹, Trish Hoang公司, Yeon-Soo-Seo先生, 陈林峰, 玛丽亚·斯皮斯

附属公司

PMID： 23393192
预防性维修识别码： PMC3616717
内政部： 10.1093/nar/gkt056

单分子分选揭示泛素化如何影响FBH1解旋酶的底物识别和活性

Tokiha Masuda-Ozawa公司等。核酸研究. 2013.

.2013年4月1日；41(6):3576-87.

doi:10.1093/nar/gkt056。 Epub 2013年2月7日。

作者

Tokiha Masuda-Ozawa公司¹, Trish Hoang公司, Yeon-Soo-Seo先生, 陈林峰, 玛丽亚·斯皮斯

附属

¹伊利诺伊大学厄本纳-香槟分校生物化学系，美国伊利诺伊州厄本纳61801。

PMID： 23393192
预防性维修识别码： PMC3616717
内政部： 10.1093/nar/gkt056

摘要

DNA修复解旋酶在细胞中起作用，分离DNA复合体或重塑核蛋白复合体。这些功能受传感和信号的影响；DNA解旋酶的细胞池可以包含携带不同翻译后修饰并执行不同生物化学功能的酶的亚群。在这里，我们报道了一种新的实验策略，单分子分选，它克服了与异源修饰的蛋白质库的综合分析相关的困难。该方法用于观察人类DNA解旋酶F-box含DNA解旋酶（FBH1）作用于类似停滞或折叠的复制叉的DNA结构及其与RAD51核蛋白丝的相互作用。使用全内反射荧光显微镜分析从人类细胞中分离出来的具有天然翻译后修饰的单个解旋酶分子。对泛素化和非泛素化FBH1分子产生的活性轨迹的分离表明，泛素化影响FBH1与RAD51核蛋白丝的相互作用，但不影响其转位酶和解旋酶活性。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
表面醚化FBH1解旋酶显示*真诚地*放松活动。(A类)基于TIRFM的分析方法的示意图，用于分析单个表面系留解旋酶分子的DNA结合和解旋。FBH1固定在显微镜流动池的表面，流动池被TIR产生的530-nm倏逝波照射。DNA底物分子含有两种荧光染料（Cy3，供体；Cy5，受体）。这两种染料都是不可见的，除非在消逝场中发现，因为它们与表面束缚解旋酶（ON状态）有关。在ATP存在下，FBH1介导的DNA底物双链区的解链导致FRET效率逐渐降低。基底离解导致信号丢失。(B类)在1 mM ATP和PD1存在的情况下，监测单个表面系留FBH1分子的活性>200 s。蓝色箭头标记的Cy3（绿色）和Cy5（红色）荧光强度的每一个峰值对应于新DNA底物的结合和重排。只分析了具有Cy3和Cy5染料荧光的事件。每个实验都产生了200-600条轨迹，这些轨迹源自与此处描述的FBH1分子类似的单个表面系留FBH1。(C类)代表性荧光轨迹的放大片段，描绘了FBH1与PD1结合并展开的三个连续事件。蓝色、橙色和黄色箭头分别表示绑定、分离和展开。(D类)个人放松活动。(E类)面板D中描述的事件中的Cy3和Cy5信号转换为FRET轨迹，可分为三个部分：DNA底物与FBH1（扁平部分）的初始结合、双链的主动解链（FRET效率线性下降）、移位的Cy5标记寡核苷酸的解离、，而Cy3（易位）寡核苷酸仍然与FBH1结合。

**图2。**
DNA结构影响FBH1的解舒和移位行为。(A类和B类)PD1和RFL基板的示意图。(**C–F类**)Δt的分布_全部的（C和D）和Δt_放松（E和F）用于PD（上部面板）和RFL（下部面板）。所有停留时间均以0.25秒的箱子尺寸装箱。(**G公司**)RFL的特定重复往返轨迹和FRET值。(**H（H）**)每个事件相对于较长事件（Δt）的分类和百分比_全部的>5 s）用于RFL。

**图3。**
FBH1型^NTD公司与ssDNA、dsDNA和RAD51相互作用。(A类)纯化FBH1的SDS–PAGE^NTD公司考马斯亮蓝染色可见。N端子带有his-tagged和C端子带有FLAG-tagged的FBH1^NTD公司表达为371个氨基酸（42kDa）多肽。净化程序概述于补充方法产生了纯FBH1^NTD公司预期分子量的蛋白质。(B类)确定FBH1^NTD公司含有二级DNA结合位点，我们通过芳香残基固有荧光的变化测试了其与ssDNA和dsDNA相互作用的能力。我们观察到FBH1与^NTD公司通过在280 nm处激发DNA，然后在320 nm处激发荧光，在无DNA和有DNA的情况下发出荧光。这种荧光变化表明芳香残基的疏水环境发生了变化，因此可以用作DNA结合的指示物。(C类)6×his-tagged FBH1之间的相互作用^NTD公司使用Ni-NTA珠上的下拉按钮研究RAD51蛋白。SDS-PAGE显示了从珠子中共同洗脱的蛋白质。

**图4。**
固定化FBH1与RAD51核蛋白丝相互作用。(A类)基于TIRFM的分析RAD51核蛋白丝与单个表面系留解旋酶分子结合的方法的示意图。实验策略与描述的DNA底物的策略类似，只是将RAD51重组酶在60mer ssDNA上组装的预制核蛋白丝用作底物。Cy3和Cy5通道中荧光的出现对应于固定化FBH1结合的核蛋白丝；两种染料之间的低FRET证实核蛋白丝已完全形成，并处于延伸（活性）构象。(B类)监测单个表面系留FBH1分子的活性>200秒。蓝色箭头表示RAD51丝状结合事件。(C类)两个约束事件的典型FRET轨迹。根据Cy3和Cy5强度计算FRET值，与DNA底物（左侧）的描述完全一致，并使用GraphPad Prism 4.0以0.05 U的间隔对每个事件（右侧）进行装箱。

**图5。**
泛素化和非泛素化FBH1分子的分类。(A类)单分子分选实验示意图。(B类)存在1 mM ATP、3 mM MgCl时泛素化FBH1的代表性轨迹₂和1 nM PD1。轨迹上显示了DNA底物与TMR-TUBE2交换的时间点、未结合的TMR-TUB2从流动池中冲洗出来的时间点以及激光关闭和打开的时间点。(C类)来自同一实验的未修饰FBH1的代表性轨迹。(D类)使用RAD51核蛋白丝作为底物的单分子分选实验的示意图。(E类)在1mM ATP、5mM MgCl存在下泛素化FBH1的代表性轨迹₂，5 mM氯化钙₂40 nM RAD51和1 nM Cy3/Cy5标记聚（dT）₆₀轨迹上显示了DNA底物与TMR-TUBE2交换的时间点、未结合的TMR-TUB2被冲洗出流动池的时间点以及激光关闭和打开的时间点。(F类)来自同一实验的未修改FBH1的代表性轨迹。

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