Chaperone-like activity of high-mobility group box 1 protein and its role in reducing the formation of polyglutamine aggregates

doi:10.4049/jimmunol.1202472

.2013年2月15日；190(4):1797-806.

doi:10.4049/jimmunol.1202472。 Epub 2013年1月9日。

高迁移率族蛋白B1的类伴侣活性及其在减少聚谷氨酰胺聚集体形成中的作用

玄金敏¹, Eun Ae Ko公司, 吴杰, Eun Sung Kim先生, 闵京权, Man Sup Kwak先生, Ji Eun Choi先生, 李钟恩, Jeon-Soo Shin先生

附属公司

PMID： 23303669
预防性维修识别码：项目经理3566580
内政部： 10.4049/吉姆诺尔.1202472

高迁移率族蛋白B1的类伴侣活性及其在减少聚谷氨酰胺聚集体形成中的作用

玄金敏等。免疫学杂志. 2013.

.2013年2月15日；190(4):1797-806.

doi:10.4049/jimmunol.1202472。 Epub 2013年1月9日。

作者

玄金敏¹, Eun Ae Ko公司, 吴杰, Eun Sung Kim先生, 闵京权, Man Sup Kwak先生, Ji Eun Choi先生, 李钟恩, Jeon-Soo Shin先生

附属

¹韩国首尔延世大学医学院微生物系，邮编：120-752。

PMID： 23303669
预防性维修识别码：项目经理3566580
内政部： 10.4049/吉姆诺尔.1202472

摘要

高迁移率族蛋白B1（HMGB1）主要存在于细胞核中，最近被证明是病毒核酸传感的前哨分子和细胞质中的自噬调节器。在本研究中，我们研究了HMGB1的伴侣样活性，发现HMGB1抑制化学诱导的胰岛素和溶菌酶聚集，以及柠檬酸合成酶的热诱导聚集。HMGB1还恢复了热诱导对仓鼠肺成纤维细胞O23细胞胞浆荧光素酶活性的抑制，作为报告蛋白表达HMGB1。接下来，我们证明HMGB1抑制了膨胀聚谷氨酰胺（polyQ）引起的聚集物的形成和毒性，这是亨廷顿病的主要病因之一。HMGB1在免疫荧光和共免疫沉淀试验中与polyQ直接相互作用，而过表达HMGB1或外源性给予重组HMGB1蛋白则显著降低SHSY5Y细胞和HMGB1（-/-）小鼠胚胎成纤维细胞中polyQ聚集体。最后，小鼠胚胎初级纹状体神经元中HMGB1蛋白的过度表达也与polyQ结合，并减少polyQ聚集物的形成。为此，我们证明HMGB1具有伴侣样活性，可能是多发性Q病的治疗候选药物。

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数字

**图1。**
HMGB1蛋白抑制靶蛋白的化学和热诱导聚集。(A类)胰岛素聚集曲线[0.8 mg/ml（A-1)]和溶菌酶[1mg/ml（A-2)]在20 mM DTT诱导的HMGB1（圆形）缺失和HMGB1存在（0.5 mg/ml；三角形）或HSP70（0.5 mg/ml；方形）的情况下。(B类-1)热处理HMGB1蛋白的聚集。rHMGB1蛋白（0.5 mg/ml）在不同温度下孵育3 h，并在340 nm处通过OD测量聚集。(B类-2和B类-三)柠檬酸合酶的热聚集。柠檬酸合成酶（0.25μM）与0.4μM HMGB1蛋白在43°C下培养90分钟。以相同分子浓度的HSP70蛋白作为阳性对照。(C类)O23细胞与荧光素酶和HMGB1质粒瞬时共转染。HSP70质粒和空载体pcDNA分别作为阳性和阴性对照。培养24小时后，用环己酰亚胺处理细胞30分钟，并在43°C下热休克处理30分钟以灭活荧光素酶*第页< 0.05, **第页与CMV-myc对照组相比<0.01(n个= 3).

**图2。**
97Q-GFP过表达产生的ROS诱导HMGB1易位。(A类)用25Q-GFP或97Q-GFP-质粒转染SHSY5Y细胞并孵育48 h。HMGB1用抗HMGB1抗体和Alexa 594结合次级抗体进行免疫染色。转染前1 h应用抗氧化剂NAC（10 mM）和Mito-tempo（25 nM），并免疫染色内源性HMGB1以比较移位程度。比例尺，10μm。(B类)计数HMGB1阳性细胞的数量**第页与97Q-GFP相比<0.01(n个= 3). DIC，差分干涉对比度。

**图3。**
HMGB1与97Q-GFP的相互作用。(A类)HMGB1与97Q-GFP共聚焦分析。用97Q-GFP转染SHSY5Y细胞，用抗HMGB1抗体进行免疫染色，观察97Q-GPP与内源性HMGB1蛋白的共定位。(B类)用25Q-GFP或97Q-GFP-和HMGB1-myc质粒共转染SHSY5Y和HEK293细胞，用抗GFP-Ab免疫沉淀细胞裂解液，然后用抗myc Ab免疫印迹检测HMGB1。以CMV-myc为对照质粒。(C类)Duolink解放军。用97Q-GFP转染SHSY5Y细胞，PLA观察97Q-GPP与内源性HMGB1蛋白的共定位。(D类)HMGB1盒蛋白A和B与97Q-GFP的相互作用。用97Q-GFP瞬时共转染SHSY5Y和HEK 293细胞，每个编码野生型HMGB1的质粒以及A盒和B盒。CMV-myc作为阴性对照质粒。细胞裂解物与抗GFP抗体共免疫沉淀（IP）97Q，然后与抗Myc抗体免疫印迹（IB）各种HMGB1。检测97Q-GFP蛋白的表达以进行负荷控制。箭头表示来自重分子量HC、H链的WT HMGB1和A、B盒蛋白。

**图4。**
HMGB1减少了97Q-GFP聚集体的形成。(A类和B类)用97Q-GFP和HMGB1-myc质粒共转染SHSY5Y细胞并培养48h。用共焦显微镜分析97Q-GPP聚集体，并计算100个GFP阳性细胞中聚集体阳性细胞的数量。箭头表示97Q-GFP骨料。pcDNA和HSP70质粒分别作为阴性和阳性对照。实验重复了三次。(C类)使用过滤陷阱分析法分析97Q-GFP骨料。用97Q-GFP和HMGB1构建物共转染SHSY5Y细胞，每个细胞裂解蛋白（200μg）通过0.22μm醋酸纤维素膜过滤，用于Western blot分析。使用Image J程序（美国国立卫生研究院）测量相对带强度。通过蛋白质印迹分析观察HMGB1-myc质粒的表达*第页< 0.05, **第页=0.001与CMV-myc对照。DIC，差分干涉对比度。

**图5。**
rHMGB1蛋白对97Q-GFP聚集体形成的影响。(A类——C类)用97Q-GFP质粒瞬时转染SHSY5Y细胞，然后用指定浓度的rHMGB1处理。观察97Q-GFP聚集物的分布（A），并在100个GFP阳性细胞中计数含有聚集物的细胞数（B）。（C）用rHMGB1处理后，测量30个聚集体的平均像素密度。(D类)将97Q-GFP质粒瞬时转染SHSY5Y细胞，然后进行rHMGB1蛋白处理。使用过滤捕集试验分析细胞裂解产物的聚集物形成。用抗GFP抗体免疫印迹滤膜，以检查聚集物的数量(*顶部面板*). 使用抗-His抗体分析穿透细胞膜的外源HMGB1蛋白的全细胞裂解物(*底部面板*). *第页与rHMGB1对照组相比<0.05(n个= 3).

**图6。**
外源处理的rHMGB1与97Q-GFP的相互作用。(A类)用97Q-GFP质粒瞬时转染SHSY5Y细胞，然后用4μg/ml的rHMGB蛋白处理。用抗GFP抗体免疫沉淀SHSY5Y细胞裂解物，并用抗-His抗体（免疫印迹[IB]）观察rHMGB1蛋白与97Q-GPP的结合。(B类)用97Q-GFP质粒瞬时转染SHSY5Y细胞，然后用4μg/ml的rHMGB蛋白处理细胞(*底部面板*). 缓冲处理控件如*上部面板*. (C类)将97Q-GFP瞬时转染SHSY5Y细胞，然后用浓度为4μg/ml的罗丹明结合rHMGB1蛋白处理，检测与97Q-GPP蛋白的直接相互作用。使用共定域散点图和强度剖面分析观察到97Q-GFP和罗丹明-rHMGB1的共定域，并在骨料上进行了测量（箭头）。控制中心。

**图7。**
HMGB1对小鼠体内97Q-GFP聚集体形成的影响*高迁移率族蛋白1*^−/−MEF细胞。(A类——D类)嗯1^−/−用97Q-GFP和HMGB1质粒的混合物电穿孔MEF细胞，通过HMGB1蛋白（a）的免疫染色观察97Q-GPP和HMGBI（箭头）的共定位。（B）在100个GFP阳性细胞中计数含有聚集细胞的数量。全细胞裂解物的滤阱分析*高迁移率族蛋白1*^−/−用97Q-GFP和HMGB1质粒共转染MEF细胞。（C）测量了相对带强度。（D）电穿孔48小时后进行细胞活性测定。GFP和空质粒作为对照质粒。使用CCK-8活性测定细胞活力。(E类——克)嗯1^−/−97Q-GFP过表达后，用罗丹明结合的rHMGB1蛋白以4μg/ml处理MEF细胞，并使用共定位散点图和强度剖面分析（E）观察共定位。（F）在100个GFP阳性细胞中计数含有聚集细胞的数量。（G）全细胞裂解物的过滤捕集分析*高迁移率族蛋白1*^−/−用rHMGB1蛋白处理MEF细胞*第页< 0.05 (n个= 3), **第页< 0.01 (n个= 3). 控制中心。

**图8。**
HMGB1对97Q-GFP诱导的细胞毒性的影响。将97Q-GFP质粒和HMGB1-myc质粒共转染SHSY5Y细胞，孵育48 h。GFP转染用于阴性对照研究。用PI染色测定细胞活力(A类)，CCK-8活性(B类)和台盼蓝染色(C类). *第页< 0.05, **第页< 0.01 (n个= 3). DIC，差分干涉对比度。

**图9。**
HMGB1对小鼠脑初级纹状体细胞97Q-GFP聚集体形成的影响。(A类——E类)在第14天分离小鼠胚胎初级纹状体神经元细胞，然后用97Q-GFP和HMGB1质粒共同转染。（A）共聚焦显微镜下观察97Q-GFP聚集体的分布。（B）在100个GFP阳性细胞中计数含有聚集细胞的数量。空白质粒用于对照组（Cntl）。（C）共转染97Q-GFP和HMGB1质粒后进行滤器陷阱分析。质粒（D）和免疫沉淀（IP）分析（E）共转染后97Q-GFP和HMGB1的克隆化。(F类——**H（H）**)用97Q-GFP质粒转染小鼠胚胎初级纹状体神经元细胞24 h，然后用4μg/ml的rHMGB1蛋白处理。（F）共焦显微镜分析97Q-GPP聚集体的分布。（G）在100个GFP阳性细胞中计数含有聚集物的细胞的数量。空白质粒作为对照组（Cntl）。使用转染97Q-GFP并与rHMGB1蛋白孵育的细胞进行滤器陷阱分析。(我)用97Q-GFP质粒转染原代纹状体神经元细胞，处理罗丹明结合的rHMGB1蛋白。共聚焦显微镜观察97Q-GFP与rHMGB1蛋白的共定位*第页< 0.05 (n个= 3). DIC，差分干扰对比度；IB，免疫印迹。

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