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.2013年1月4日;12(1):260-71.
doi:10.1021/pr300630k。 Epub 2012年12月18日。

人类癌细胞磷酸蛋白质组的综合表征

附属公司

人类癌细胞磷酸蛋白质组的综合表征

周厚江等。 蛋白组学研究杂志. .

摘要

基于质谱(MS)的磷酸蛋白质组学在细胞蛋白磷酸化的定性和定量分析方面取得了巨大成功。考虑到细胞中磷酸化的估计水平远高于100000个位点,仍有很大的改进空间。在这里,我们试图扩展磷酸蛋白质组覆盖的深度,同时在可用材料、稳健性和仪器运行时间方面保持现实的期望。我们制定了三种策略,每种策略都在这三个关键参数之间提供了不同的平衡。第一种策略简单地使用Ti(4+)-IMAC富集,然后使用反向色谱LC-MS(称为1D)。第二种策略通过使用HILIC(2D)包含了额外的分馏步骤。最后,设计了第三种策略,首先采用SCX分馏,然后采用Ti(4+)-IMAC富集和HILIC(3D)额外分馏。对HeLa细胞系进行了初步评估。在大约2小时内检测3700个磷酸肽,发现1D策略最敏感,但综合性有限,主要是因为存在复杂性和动态范围的问题。总的来说,使用基于2D的策略实现了最佳平衡,在大约48小时内识别出接近17000个含有小于1 mg物质的磷酸肽。随后,我们用K562细胞样本证实了这一发现。当有足够的材料可用时,3D策略增加了磷酸蛋白质组,从而能够识别22000多种独特的磷酸肽。不幸的是,3D策略需要更多的时间和超过1毫克的材料才能开始超越2D。最终,结合所有策略,我们能够分别从癌细胞系HeLa和K562中鉴定出16000多个和近24000个独特的磷酸化位点。总之,我们证明了需要进行广泛的分馏以深度挖掘磷酸蛋白质组,并根据样本量和/或分析时间为适当的策略提供了指导。

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