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.2013年1月；33(1):76-86.
doi:10.1161/ATVBAHA.112.251736。 Epub 2012年11月1日。

Notch3靶基因的转录组分析确定Grip2是脑血管系统肌源性反应的新调节因子

查尔斯·福伊莱德 1, 塞琳·蒙古伊男爵, 瓦莱里·多明加·德尼尔, 克里斯蒂尔·蒂鲍特, Kogo Takamiya公司, 理查德·胡加尼尔, 安妮·朱特尔
附属公司

Notch3靶基因的转录组分析确定Grip2是脑血管系统肌源性反应的新调节因子

查尔斯·福伊莱德等。 动脉硬化血栓血管生物. 2013年1月.

摘要

目标：Notch3对远端动脉，尤其是脑动脉的结构和肌源性反应至关重要。然而，作用于Notch3下游的信号通路在很大程度上仍然未知。

方法和结果：利用Notch3-null小鼠的尾动脉进行转录组分析，确定了一组17个新的Notch3-调节基因的核心，这些基因已在尾动脉或脑动脉中得到证实。平滑肌细胞RBP-Jκ的出生后缺失再现了Notch3缺陷引起的脑动脉结构、功能和分子缺陷。除了Notch3外，使用γ-分泌酶抑制剂对Notch通路的体内短暂阻断还发现了6种即时反应，包括电压门控钾通道Kv1.5，它反对脑动脉肌源性收缩，以及谷氨酸受体相互作用蛋白2（Grip2）之前在脑血管系统中没有确定的作用。我们鉴定了Grip2的血管平滑肌细胞亚型。我们发现Notch3-RBP-Jκ特异性调节这种亚型。最后，我们发现Grip2突变小鼠的脑动脉表达一个N末端截断的Grip2蛋白，表现出压力诱导收缩的选择性减弱。

结论：我们的数据提供了对Notch3在脑动脉中如何发出信号的见解，从而确立了在这种情况下出生后对平滑肌RBP-Jκ的需求。Notch3调节的转录组提供了调节脑血管系统肌源性反应的潜力。

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数字

图1
图1。出生后SMC RBP-Jκ缺失导致脑动脉结构、功能和分子缺陷
（A–D）：显示了用甲苯胺蓝染色的野生型（A，C）和SM-RBP-J-KO（B，D）小鼠大脑中动脉的代表性半薄切片。C和D是A和B（E–F）所示图像的放大倍数：所示为用α-平滑肌肌球蛋白重链抗体（G）免疫染色的野生型（E）和SM-RBP-J-KO（F）小鼠的脑动脉：内径（顶面）、中层厚度（中面）和弹性层指数（内外周长）的定量测量SM-RBP-J-KO（n=5）和对照小鼠（n=6）（H）的（底部面板）：野生型小鼠（n=5）和SM-RBP-G-KO小鼠（n=3）大脑后动脉对压力逐步增加（肌张力）的反应表明，突变小鼠的肌张力显著减弱（I）：SM-RBPJ-KO脑动脉中Notch3靶基因的QRT-PCR分析，表示为对照动脉的折叠变化（*，p<0.05；**，p<0.01和***，p<0.001）。标尺50μm（A、B、E、F）和10μm in（C-D）；流明
图2
图2。体内药物暂时阻断Notch信号传导导致Notch3调节基因子集下调
LY-411575和车用NAS小鼠脑动脉Notch3靶基因的QRT-PCR分析。在治疗3和5天后收集动脉。Q-PCR分析槽口3和β-半乳糖苷酶这些转录本作为对照来验证Notch信号阻断（A）。显示LY-411575治疗（B）后基因表现出显著下调（*，p<0.05；**，p<0.01和***，p<0.001）
图3
图3。在动脉平滑肌细胞中检测到Grip2转录物和蛋白质
（A–F）：现场与a杂交把手2在1个月大的野生型小鼠的皮层（A，D）、肾脏（B，E）和肠系膜（C，F）切片上的反义核糖探针。所示为明亮（A–C）和暗场（D–F）图像。把手2与静脉（G-I）相比，在动脉中信号强的血管中检测到表达：用抗GRIP-2（G）和α-平滑肌肌动蛋白（H）抗体对脑动脉进行免疫标记，结果显示GRIP-2阳性细胞与α-平滑肌肌动蛋白阳性细胞重叠（I，merge）（J）：用抗GRIP-2抗体（上表）和α-平滑肌肌动蛋白抗体（下表）对Notch3野生型和KO小鼠脑动脉裂解物制备的代表性免疫印迹显示GRIP-2在野生型动脉中表达，在Notch3KO动脉中表达减少，标尺为50μm（A-I）；A、 动脉；五、 静脉
图4
图4。夹具2编码由Notch3-RBPJκ调节的血管亚型
（A） ：的示意图把手2人、小鼠和大鼠的基因座。虚线框表示通过生物信息学分析（B–C）：RT-PCR分析把手2全脑、脑动脉和尾动脉的亚型。从每个组织的1μg总RNA制备cDNA，用一对对每种同种型特异的引物扩增，并在琼脂糖凝胶中分离（B）。的表达式级别把手2亚型根据总量标准化把手2（C） （D–E）：RT-PCR分析把手2Notch3KO和对照小鼠脑动脉中的亚型。的表达式级别把手2亚型和总量把手2根据标准化β肌动蛋白（F–G）：RT-PCR分析把手2SM-RBP-J-KO和对照小鼠脑动脉中的亚型。的表达式级别把手2亚型和总量把手2根据标准化β肌动蛋白（*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001）
图5
图5。Grip2的脑动脉突变体小鼠表现出正常的结构，但肌源性反应减少
（A–B）：大脑中动脉的代表性半薄切片把手2用甲苯胺蓝染色的野生型（A）和突变型（B）小鼠显示突变动脉无明显结构缺陷比例尺10μm（A–B）（C）：野生型（n=7）和把手2突变小鼠（n=8）表明，突变小鼠的肌原性张力显著减弱（**，p<0.01）
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