The zinc finger protein ZNF268 is overexpressed in human cervical cancer and contributes to tumorigenesis via enhancing NF-κB signaling

doi:10.1074/jbc.M112.399923

.2012年12月14日；287(51):42856-66.

doi:10.1074/jbc。M112.399923。 Epub 2012年10月22日。

锌指蛋白ZNF268在人宫颈癌中过度表达，并通过增强NF-κB信号通路促进肿瘤发生

王伟（音译）¹, 郭明雄, 李虎, 蔡金阳, 闫曾, Jun Luo先生, 舒志强, 李文新, 赞晃（Zan Huang）

附属公司

PMID： 23091055
预防性维修识别码：项目经理3522282
内政部： 10.1074/jbc。M112.399923号

锌指蛋白ZNF268在人宫颈癌中过度表达，并通过增强NF-κB信号通路促进肿瘤发生

王伟（音译）等。生物化学杂志. 2012.

.2012年12月14日；287(51):42856-66.

doi:10.1074/jbc。M112.399923。 Epub 2012年10月22日。

作者

王伟（音译）¹, 郭明雄, 李虎, 蔡金阳, 闫曾, Jun Luo先生, 舒志强, 李文新, 赞晃（Zan Huang）

附属

¹武汉大学中南医院病毒学国家重点实验室，湖北武汉430072。

PMID： 23091055
预防性维修识别码：下午3522282
内政部： 10.1074/jbc。M112.399923号

摘要

宫颈癌是影响全世界妇女健康的最常见肿瘤之一。虽然在几乎所有的病例中都能检测到人乳头瘤病毒，但宫颈癌发生的机制仍有待进一步研究。在这里，我们证明了ZNF268，一种与Krüppel相关的含盒锌指蛋白，可能有助于宫颈癌的发展。我们发现ZNF268b2是ZNF268的一种亚型，在人类宫颈鳞癌标本中过度表达。ZNF268在宫颈癌细胞中的敲除导致细胞周期停滞在G（0）/G（1）期，减少集落形成，并增加对TNFα诱导的凋亡的敏感性。此外，ZNF268敲除可抑制异种裸鼠体内HeLa细胞的生长，并增加细胞凋亡。此外，ZNF268b2在体内外均能增强NF-κB信号传导。NF-κB活性的重建恢复了ZNF268击倒HeLa细胞的增殖。值得注意的是，我们在ZNF268过度表达的宫颈癌组织中观察到NF-κB的高激活频率，这表明ZNF268b2过度表达和NF-κ的B激活在病理学上是一致的。综上所述，我们的结果揭示了ZNF268b2的一种新作用，其部分通过增强NF-κB信号通路参与宫颈癌的发生。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**ZNF268在宫颈癌组织中过度表达。** *A、，*宫颈组织中ZNF268免疫组化染色的代表性图像。E3和SD抗体分别用于免疫组织化学检测ZNF268a和ZNF268/ZNF2682b2蛋白。N个表示宫颈鳞状上皮正常；C类表明鳞状细胞癌；*面板I–III*分别表示高分化鳞癌、中分化鳞癌和低分化鳞癌。*比例尺，*50微米。*B、，*各组免疫组化的ZNF268表达得分表示为平均值±S.D.双尾Student’St吨本试验旨在比较ZNF268在正常组织和宫颈癌组织中的表达(*左侧面板*). ZNF268在不同分化程度宫颈鳞癌中的表达(*右侧面板*)也进行了比较。数字在里面*圆括号*指出所研究样本的数量。***表示第页< 0.001;纳秒表示第页> 0.05.C、，ZNF268在两种含有正常鳞状上皮的宫颈组织中表达的代表性免疫组织化学图像(N个)和鳞癌(C类).比例尺，100微米(*左侧面板*)和50微米(*右侧面板*).右侧面板是放大的图片*盒装场地*在里面*左侧面板。D中，*采用QD技术检测ZNF268a和ZNF2682b在宫颈癌中的相对表达。*面板1*(绿色)用于ZNF268a。*面板2*(红色)用于ZNF268a/ZNF268b2。*面板3*和4表明了共同定位(*科洛科的*)信号(绿色和*红色信号灯*)和合并结果。表达式信号的统计显示在*右侧面板。比例尺，*50微米。

**图2。**
**ZNF268基因敲除对HeLa细胞增殖的影响*在体外*.** *A、，*HeLa细胞被表达ZNF268特异性shRNA的慢病毒感染(*shZNF268型*)或控制矢量(*sh控制*)通过排序选择GFP阳性。用定量RT-PCR测定ZNF268的敲除(*左侧面板*)和Western印迹(*右侧面板*).B、，将sh对照细胞和shZNF268 HeLa细胞接种在96 well板中。在指定的时间点进行MTT分析。将数据标准化至第1天（电镀后1天），并以增殖率表示。*C、，*sh对照和shZNF268 HeLa细胞（4.0×10^三细胞/培养皿*第1组*和8.0×10^三细胞/培养皿*第2组*)也接种在35mm软琼脂培养皿中。接种后2周计数菌落数，以确定其抗集落形成能力。*D中，*用EdU（50μ米). 通过免疫荧光染色测定EdU掺入量，并在荧光显微镜下计数。*左侧面板*是具有代表性的结果，以及*右侧面板*是EdU标记实验的统计数据。*E、，*在生长指数期收集sh对照细胞和shZNF268 HeLa细胞，用PI染色，流式细胞仪分析。用ModFit软件分析sh对照和shZNF268 HeLa细胞的细胞周期谱。*F、，*Western blot检测细胞周期蛋白D1、E2和PCNA在sh对照细胞和shZNF268 HeLa细胞中的表达。肌动蛋白被用作蛋白质负载对照。*表示第页< 0.05; ** 表示第页< 0.01.

**图3。**
**ZNF268基因敲除促进TNFα/CHX刺激HeLa细胞诱导的凋亡。** *A、，*用TNFα加CHX处理sh对照细胞和shZNF268 HeLa细胞，处理时间为所示时间（0、12和24 h）。PI染色检测细胞凋亡，检测亚G₁细胞计数及流式细胞术分析。数字显示凋亡细胞的百分比。*B、，*通过Western blot检测前蛋白酶3和前PARP裂解也证实了用TNFα加CHX处理的sh对照和shZNF268 HeLa细胞的凋亡。*C、，*用切割caspase 3特异性抗体和TRITC标记的免疫荧光法进一步测定前caspase 2的裂解。DNA用DAPI染色检测凋亡细胞核。GFP在sh对照细胞和shZNF268细胞中均表达。还显示了三种颜色的合并图片。高炉表示亮场。*比例尺，*10微米。

**图4。**
**ZNF268通过TNFα诱导增强NF-κB活化。** *A、，*用NF-κB-luc转染sh对照组或shZNF268 HeLa细胞，并用或不用TNFα（20 ng/ml）处理6 h(*TNF公司*α）通过测定荧光素酶活性监测细胞。*B、，*用NF-κB-luc+控制载体或ZNF268b2转染HeLa细胞(*b2型*)治疗（TNFα）或未治疗TNFα（20 ng/ml）6 h。通过测量荧光素酶活性来监测NF-κB的激活。*C、，*用NF-κB-luc+控制载体或ZNF268b2转染HeLa细胞(*b2型*)与所示的其他矢量组合。用TNFα进一步处理细胞6 h，并监测NF-κB活性。*D中，*用Gal4-luc和指示的诱饵（对照或ZNF268b2）和猎物构建体（IKKα、IKKβ或IKKγ）转染HeLa细胞。通过监测荧光素酶活性，确定ZNF268b2与IKKα、IKKβ或IKKγ的相互作用。*E、，*HeLa细胞用TNFα（20 ng/ml）处理指定时间。全细胞裂解物(*WCL公司*)然后进行免疫沉淀(*IP（IP）*)用IKKα抗体或对照IgG，然后用指示的抗体进行免疫印迹。还对全细胞裂解物进行免疫印迹，以验证免疫沉淀所需的等量蛋白质。星号表示非特异性结合。*F、，*将Gal4-luc与ZNF268b2联合转染HeLa细胞(*b2型*)或对照和IKKα、IKKβ或IKKγ（诱饵）和IKKα、IKKβ或IKKγ（猎物）。通过监测荧光素酶活性来检测同型或异型复合体的形成。*G、，*用ZNF268b2转染HeLa细胞(*b2型*)或对照组，用TNFα（20 ng/ml）刺激指定时间（0、5和10分钟），并用所示抗体进行印迹。*H、，*用ZNF268b2转染HeLa细胞(*b2型*)或对照组，用TNFα（20 ng/ml）刺激指定时间。细胞质提取物(*总工程师*)和核提取物(无)分离，然后进行Western blotting分析。PARP和肌动蛋白被用作核提取物和细胞质提取物分离质量的内部控制。我，控制载体或ZNF268b2的核提取物(*b2东北*)转染TNFα的HeLa细胞用于EMSA检测NF-κB DNA结合活性。ZNF268b2过表达增加了NF-κB的DNA结合。*表示第页< 0.05; ** 表示第页< 0.01.

**图5。**
**NF-κB活性的重建可以挽救ZNF268敲除诱导的增殖抑制和凋亡。** *A、，*用组成活性p65转染sh对照细胞或shZNF268 HeLa细胞，并筛选出对嘌呤霉素耐药的细胞。Western blot检测p65和ZNF268在HeLa细胞中的表达。*B、，*p65过度表达可恢复因ZNF268敲除而受损的NF-κB活性。用所示质粒转染HeLa细胞，并在转染后48 h进行荧光素酶检测。*C、，*ZNF268敲低HeLa细胞中p65的过度表达挽救了细胞增殖抑制。用控制载体或组成活性p65转染sh对照或shZNF268 HeLa细胞。在指定的时间点进行MTT分析。将数据标准化至第1天（电镀后1天），并以增殖率表示。*D中，*p65在ZNF268敲低HeLa细胞中的过度表达显著降低了细胞死亡。如图所示，用质粒转染细胞。24h后，用TNFα加CHX再处理24h，PI染色检测细胞凋亡，流式细胞仪分析细胞凋亡情况。

**图6。**
**在HeLa细胞异种移植裸鼠模型中，ZNF268基因敲除可抑制肿瘤生长和NF-κB活化。** *A、，*sh对照或shZNF268 HeLa细胞（5×10⁶)裸鼠皮下注射。在注射后30天收集受体小鼠形成的肿瘤。植入ZNF268敲除细胞的受体小鼠的肿瘤显示体积和重量减小(n个= 5).右侧面板是异种移植物实验的统计数据*左侧面板*.*表示第页< 0.05; ** 表示第页< 0.01.B和*C、，*对随机选择的三只sh对照或shZNF268受体小鼠的肿瘤进行Western blot分析，并显示抗体。*D中，*核能(N个)和细胞质(C类)从移植有sh对照细胞或shZNF268 HeLa细胞的受体小鼠的肿瘤中提取提取物。用Western blot分析肿瘤中p65和p50的亚细胞定位。PARP和肌动蛋白被用作核蛋白和细胞质蛋白组分质量的内部控制。从sh对照组和shZNF268组中随机选择三个肿瘤进行Western blot分析。结果是来自三个独立实验的代表性斑点。

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