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.2012年11月；20(11):2052-63.
doi:10.1038/mt.2012.125。 Epub 2012年6月26日。

GOLGA2/GM130，顺高尔基基质蛋白，是抗癌基因治疗的新靶点

Seung-Hee Chang先生 1, Seong-Ho-Ho Hong先生, 胡林江, 阿拉什·米纳伊·特拉尼, 庆南裕, 李在浩, 金继恩（Ji-Eun Kim）, Ji-Young Shin公司, 比特纳·康, Sungjin公园, 韩基元（Kiwon Han）, Chanhee Chae先生, 明珠
附属公司

GOLGA2/GM130，顺高尔基基质蛋白，是抗癌基因治疗的新靶点

Seung-Hee Chang先生等。 分子治疗. 2012年11月.

摘要

对于转移性和晚期肿瘤的治疗，常规化疗治疗的肺癌患者实现长期生存仍然很困难。尽管最近在试验治疗方面取得了进展，但生存率仍然低得令人失望，迫切需要新的辅助和系统治疗。最近阐明的一种分泌途径作为一种有前途的抗癌靶点，正引起人们的极大兴趣。顺高尔基基质蛋白GOLGA2/GM130在分泌途径中的糖基化和蛋白质转运中起着重要作用。在本研究中，在体外和体内评估了靶向GOLGA2/GM130（shGOLGA2）的短发夹RNA（shRNA）构建物对自噬和肺癌生长的影响。GOLGA2/GM130的下调导致A549细胞和K-ras（LA1）小鼠肺部的自噬诱导和糖基化抑制。此外，下调GOLGA2/GM130可减少体外血管生成和癌细胞侵袭，并抑制肺癌小鼠模型的肿瘤发生。GOLGA2/GM130序列的肿瘤特异性也得到了证实。综上所述，这些结果表明shGOLGA2诱导自噬可能导致细胞死亡而非细胞存活。因此，下调GOLGA2/GM130可能是肺癌的潜在治疗选择。

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数字

图1
图1
shGOLGA2下调GOLGA2/GM130诱导A549细胞自噬. (一)GOLGA2/GM130的qPCR分析。稳定下调的细胞培养24小时，然后从培养细胞中分离总RNA并合成cDNA，然后进行qPCR。数值代表平均值±SEM(n个= 4). (b条,d日)GOLGA2/GM130和LC3。细胞裂解物进行western blot分析。用GM130抗体（小鼠单克隆IgG2a；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cru z，CA）或MAP1LC3抗体（纯化小鼠单克隆抗体；ABGENT，San Diego，CA）检测印迹。右侧面板显示了感兴趣波段的密度分析结果。数值为平均值±SEM(n个= 3).#P（P）<0.05被认为是显著的***P（P）<0.001或###P（P）<0.001与相应的对照值相比具有高度显著性。(c（c）)TEM分析的代表性结果；稳定下调GOLGA2/GM130（shGOLGA2）、scramb（shScr）或control（Con）的A549细胞培养2天并通过TEM成像。箭头和橙色虚线圆圈分别表示初级溶酶体和次级溶酶体。棒材代表1µm。(e（电子）)下调GOLGA2（shGOLGA2）、扰民（shScr）或对照（Con）的A549细胞中LC3的免疫荧光。将稳定下调的细胞孵育3天，然后固定并免疫染色LC3（绿色通过Alexa Fluor 488）和细胞核（蓝色通过DAPI）。作为阳性对照的BFA（1µg/ml）预处理24小时。棒材代表10µm。BFA，布雷费尔丁A；DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚；高尔基，高尔基器械；Nu，细胞核；qPCR，定量PCR；短发夹RNA；TEM，透射电子显微镜。
图2
图2
下调GOLGA2/GM130抑制蛋白糖基化并诱导A549细胞自噬. (一,b条)RL2和LC3的Western blot分析。将稳定下调的细胞用BFA（1µg/ml）预处理2或4小时，然后收获用于western blot分析（RL2，抗O-连接的N-乙酰氨基葡萄糖单克隆抗体；Thermo Fisher Scientific，加利福尼亚州圣何塞市）。用GOLGA2/GM130表达载体或控制载体（Vec）瞬时转染A549细胞，用BFA（1µg/ml）预处理GOLGA2-GM130过表达细胞4小时。右侧面板描绘了一个示意模型，该模型显示了GOLGA2/GM130对分泌途径作用的拟议机制。(c（c）——e（电子）)稳定下调细胞的TEM分析。用每天更换、固定并通过TEM分析的新鲜培养基培养细胞3、4或7天。BFA处理的细胞被用作自噬阳性对照。箭头和红点圆圈表示自噬体。条形代表2、1和0.2µm。星号（*）表示自噬小泡（AV）。BFA，布雷费尔丁A；M、 线粒体；Nu，细胞核；透射电子显微镜。
图3
图3
下调GOLGA2/GM130抑制A549细胞的血管生成和侵袭. (一)血管生成的qPCR分析。从培养72小时的细胞中提取总RNA并合成cDNA，然后进行qPCR。数值代表平均值±SEM(n个= 4). (b条)血管生成的Western blot分析。细胞裂解物进行western blot分析。用FGF-2抗体（兔多克隆IgG；Santa Cruz Biotechnology）或VEGF抗体（小鼠单克隆IgG2a；Santa Cruz Bietechnologies）检测斑点。右侧面板总结了感兴趣波段的密度测定分析结果。数值代表平均值±SEM(n个= 3). **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001或##P（P）< 0.01,###P（P）<0.001与相应的对照值相比具有高度显著性。(c（c）)在具有下调的GOLGA2/GM130、扰乱或对照的A549细胞中的侵袭测定。将稳定下调的细胞加入入侵室并培养48小时。生长后，侵入细胞用CyQuant GR染料（绿色）染色并用光学显微镜观察。棒材代表10µm。(d日)为了测量侵袭的相对强度，细胞用CyQuant GR染料染色，并用多平板阅读器读取。数值为平均值±SEM(n个= 3). ***P（P）<0.001或###P（P）<0.001与相应的对照值相比具有高度显著性。(e（电子）)实时细胞增殖测定；使用xCELLigence RTCA DP系统对稳定下调的细胞进行50小时的测量(n个= 4). 数值为平均值±SEM***P（P）<0.001与Con（对照，红线），###P（P）<0.001与shScr（加扰，绿线）。成纤维细胞生长因子；qPCR，定量PCR；RFU，相对荧光单位；短发夹RNA；血管内皮生长因子。
图4
图4
下调GOLGA2/GM130抑制K肺肿瘤的发生-ras（拉斯维加斯）拉丁美洲1老鼠. (一)K患者肺部肿瘤病理学-ras（拉斯维加斯）拉丁美洲1老鼠。K的肺部病理检查-ras（拉斯维加斯）LA1型小鼠每周两次暴露于含有GPT-SPE/shGOLGA2的气溶胶中，共4周。红色虚线圆圈表示K的肺部肿瘤肿块-ras（拉斯维加斯）拉丁美洲1老鼠。(b条,c（c）)K的肺部肿瘤总数和肿瘤体积-ras（拉斯维加斯）拉丁美洲1老鼠；10周龄K大鼠肺部肿瘤平均直径至少为1.0 mm-ras（拉斯维加斯）拉丁美洲1老鼠。数值为平均值±SEM(n个= 6). **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001,#P（P）<0.05或###P（P）与相应的对照值相比，<0.001被认为是显著的。(d日)K肺组织学检查-ras（拉斯维加斯）拉丁美洲1老鼠。红色圆圈表示K肺腺癌或腺瘤-ras（拉斯维加斯）LA1型老鼠。棒材代表100µm。
图5
图5
GOLGA2/GM130下调诱导K细胞在肺部自噬-ras（拉斯维加斯）拉丁美洲1老鼠. (一)GOLGA2/GM130的qPCR分析。从肺组织中分离总RNA并合成cDNA，然后进行qPCR。数值代表平均值±SEM(n个= 4). (b条,c（c）)GOLGA2/GM130、RL2和LC3的Western blot分析。肺组织匀浆进行western blot分析。如图所示，用抗体对斑点进行检测。右侧面板显示了感兴趣波段的密度分析结果。数值为平均值±SEM(n个= 3). **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001或###P（P）< 0.001, ##第页<0.001与相应的对照值相比具有高度显著性。(d日)肺中LC3的免疫组织化学分析。深棕色表示LC3表达。棒材代表50µm。下部面板显示LC3标记指数的比较结果。LC3阳性染色测定在×400放大倍数下每100个细胞中二氨基联苯胺阳性细胞的百分比。数值为平均值±SEM(n个= 4). ***P（P）<0.001或###P（P）<0.001与相应的对照值相比具有高度显著性。(e（电子）)K肺的透射电镜分析-ras（拉斯维加斯）拉丁美洲1老鼠。固定并分析肺组织。箭头和红色圆点表示自噬体。条形代表5（顶部）、2（中部）和1（底部）µm。LB，层状体；M、 线粒体；Nu，细胞核；qPCR，定量PCR；短发夹RNA；TEM，透射电子显微镜。
图6
图6
下调GOLGA2/GM130抑制K细胞肺部的血管生成和增殖-ras（拉斯维加斯）拉丁美洲1老鼠. (一,c（c）,e（电子）)FGF-2、VEGF、CD31（纯化抗小鼠CD31；BD Pharmingen，加利福尼亚州圣何塞）和PCNA（小鼠单克隆IgG2a；圣克鲁斯生物技术）的Western blot分析。肺组织匀浆进行western blot分析。如图所示，用抗体对斑点进行检测。右侧面板显示了感兴趣波段的密度分析结果。数值为平均值±SEM(n个=3）*P（P）<0.05或#P（P）<0.05被认为是显著的**P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001或##P（P）< 0.01,###P（P）<0.001与相应的对照值相比具有高度显著性。(b条,d日,（f）)肺中VEGF、CD31和PCNA的免疫组织化学分析。深棕色表示该表达式。棒材代表50µm。右侧面板显示LC3、CD31或PCNA标记的比较结果。LC3、CD31或PCNA阳性染色确定了放大400倍时每100个细胞中二氨基苯扎定阳性细胞的百分比。数值为平均值±SEM(n个= 4). ***P（P）<0.001或###P（P）<0.001与相应的对照值相比具有高度显著性。成纤维细胞生长因子；增殖细胞核抗原；短发夹RNA；血管内皮生长因子。
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