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.2012年6月8日；287(24):20208-20.
doi:10.1074/jbc。M111.336255。 Epub 2012年4月20日。

脂多糖诱导的Toll-like受体4信号传导和肾厚升支离子转运抑制需要Toll-licke受体2

大卫·W·好 1, 桑皮·乔治, Bruns A Watts第三
附属公司

脂多糖诱导的Toll-like受体4信号传导和肾厚升支离子转运抑制需要Toll-licke受体2

大卫·W·好等。 生物化学杂志. .

摘要

先前我们证明，基底外侧LPS通过TLR4依赖性ERK激活抑制肾髓质厚升支（MTAL）中HCO（3）（-）的吸收。这里我们报告MTAL对基底外侧LPS的反应除了TLR4外还需要TLR2。基底侧添加LPS（超纯大肠杆菌K12）降低了野生型小鼠隔离、灌流MTAL对HCO（3）（-）的吸收，但对TLR2（-/-）小鼠的MTAL没有影响。相反，内腔LPS对HCO（3）（-）吸收的抑制作用在TLR2（-/-）MTALs中得以保留，表明TLR2特别参与调节基底外侧LPS反应。LPS也没有增加TLR2（-/-）小鼠MTALs中ERK的磷酸化。TLR2缺乏对TLR4、MD-2或MyD88的表达没有影响。然而，在TLR2（-/-）MTALs中，LPS诱导的MyD88向基底外侧膜的募集受到损害。LPS抑制HCO（3）（-）吸收不需要CD14。协同免疫沉淀研究表明TLR4和TLR2之间存在关联。TLR4（-/-）小鼠的MTAL中保留了TLR2特异性配体对HCO（3）（-）吸收的抑制作用。这些结果表明，基底侧LPS通过MyD88依赖性ERK激活抑制MTAL中HCO（3）（-）吸收的作用取决于TLR4和TLR2之间的新型相互作用。TLR2通过与TLR4合作，通过LPS介导ERK信号，以及通过由革兰氏阳性细菌配体激活的TLR4诱导的依赖性信号通路，在诱导损害MTAL功能的细胞内信号方面发挥双重作用。TLR2表达的调控及其与TLR4的相互作用可能为TLR4介导的LPS反应的控制和靶向治疗提供新的机制。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
浴和腔LPS对HCO的影响三−TLR2对MTALs的吸收−/−老鼠。来自野生型和TLR2的MTAL−/−给小鼠灌胃在体外在对照溶液中，然后是LPS（超纯大肠杆菌K12）添加到浴中并从浴中移除(A类和B类)或管腔(C类和D类)解决方案。浴中LPS为500 ng/ml，流明为250 ng/ml（14，32）。HCO绝对速率三−吸收（JHCO三−)按照“实验程序”所述进行测量。数据点是单管的平均值。线连接在同一小管中进行的成对测量。第页值用于配对t吨测试。NS公司，不显著。平均值在“结果”下给出
图2。
图2。
LPS诱导的ERK激活需要TLR2。 A类，从野生型和TLR2解析了MTAL−/−小鼠被孵育在体外在37°C下，在无LPS（对照）和有LPS（500 ng/ml）的情况下放置15分钟。然后固定小管，用抗p-ERK抗体染色，并按照“实验程序”中详细说明的共焦免疫荧光分析。图像如下z（z）通过小管中心平面拍摄的轴截面（0.4μm），显示了小管外侧壁细胞的横截面图（14、32、46、51）。LPS增加了野生型小鼠MTALs中的p-ERK标记，但对TLR2中的MTALs没有影响−/−老鼠。图像代表了每种类型的至少九个小管。比例尺，5微米。B类，p-ERK染色强度在A类如“实验程序”所述，并表示为在同一实验中测量的控制水平的百分比。酒吧，表示±S.E.*，第页< 0.05与野生型控制。C类，来自TLR2的MTAL−/−在37°C的温度下，在没有醛固酮（对照）和有醛固酮的情况下孵育小鼠（1 n米)持续15分钟，然后通过共焦免疫荧光分析p-ERK染色A类图像代表每种类型至少六个小管。D类，p-ERK染色强度在C类如“实验程序”中所述，并表示为在同一实验中测量的对照水平的百分比。*，第页< 0.05与控件。
图3。
图3。
TLR2在MTALs中的表达−/−老鼠。 A类，从野生型和TLR2解析了MTAL−/−用抗TLR4抗体（Abcam）对小鼠进行染色（14），并用共焦免疫荧光分析，如图2图例所示A类TLR4染色存在于基底外侧(箭头)和顶端(箭头)膜域。图像代表了每种类型的至少九个小管。B类，TLR4染色强度在基底外侧和顶端膜域以及细胞质中被量化，用于A类如“实验程序”所述。TLR2的荧光强度−/−小管以同一实验中测量的野生型值的百分比表示。酒吧，表示±S.E.TLR2−/−这三个区域的值与野生类型没有区别。C类、野生型和TLR2外髓质内条的裂解物−/−用多克隆抗TLR4抗体（Abcam）对小鼠进行免疫印迹。用50μg蛋白质/车道装载印迹。每个通道包含来自不同鼠标的样本。表观分子质量显示在正确的对平行凝胶进行考马斯蓝染色，以验证所有通道中的蛋白质负载相等（未显示）。TLR4蛋白丰度通过密度测定法定量，TLR2的带密度−/−小鼠以野生型值的百分比表示。酒吧，表示±S.E.TLR2−/−值与野生类型的值没有区别。
图4。
图4。
MyD88和MD-2在TLR2中的表达−/−老鼠。野生型和TLR2外髓内条裂解物−/−使用抗MyD88抗体对小鼠进行免疫印迹(A类)或抗MD-2(B类)抗体。印迹液中每道蛋白含量为50μg。每个通道包含来自不同鼠标的样本。表观分子质量显示在正确的MyD88和MD-2蛋白丰度通过密度测定法进行量化，TLR2的带密度−/−小鼠以野生型值的百分比表示。酒吧，表示±S.E.TLR2−/−值与野生类型的值没有区别。
图5。
图5。
TLR2和TLR4在外髓质内条的共免疫沉淀。 A类，来自外髓质内条纹的组织(国际标准化组织)大鼠肾脏的在体外在37°C下，在没有LPS（对照）和有LPS（500 ng/ml）的情况下保持15分钟。细胞裂解物被免疫沉淀(IP（IP）)用抗TLR2抗体（InvivoGen），免疫沉淀被免疫印迹(IB公司)使用抗TLR4（Abcam）或抗TLR2（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）抗体。B类、野生型和TLR2肾脏内条纹组织−/−小鼠被孵化在体外在37°C下，在无LPS（对照）和有LPS的情况下保持15分钟。用抗TLR2抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀，并用抗TLR4或抗TLR2的抗体对免疫沉淀进行免疫印迹，如A类细胞裂解物也直接用抗TLR4抗体进行免疫印迹。C类用抗TLR4抗体（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）免疫沉淀大鼠肾脏的内条组织，并用抗TLR2或抗TLR3抗体免疫印迹免疫沉淀，如答：D用抗TLR2抗体免疫沉淀大鼠肺和心脏的细胞裂解物，用抗TLR4或抗TLR2的抗体免疫印迹免疫沉淀物，如A类用抗TLR4抗体直接对裂解产物进行免疫印迹。印迹代表每种类型的两到四个独立实验。
图6。
图6。
LPS诱导的MyD88向基底外侧膜结构域的募集在TLR2的MTAL中受损−/−老鼠。 A类，从野生型和TLR2解析了MTAL−/−小鼠被孵育在体外在37°C下，在无LPS（对照）和有LPS（500 ng/ml）的情况下保持15分钟。然后用抗MyD88抗体对小管进行染色，并用共焦免疫荧光分析，如图2图例所示A类LPS增加了野生型小鼠MTAL基底外侧膜上MyD88的标记(箭头)但对TLR2的MTAL没有影响−/−老鼠。图像代表每种类型至少五个小管。B类，MyD88在基底外侧膜域的染色强度在A类如“实验程序”所述，并以同一实验中测量的控制水平的百分比表示。酒吧，表示±S.E.*，第页< 0.05与控件。
图7。
图7。
抑制HCO不需要CD14三−基底侧LPS吸收。野生型MTAL(A类)和CD14−/−(B类)给小鼠灌胃在体外在控制条件下，然后将LPS（500 ng/ml）添加到镀液中并从镀液中去除。JHCO公司三−、数据点、线和第页值如图1所示。平均值在“结果”下给出
图8。
图8。
HCO的抑制三−TLR2激动剂的吸收不需要TLR4。来自TLR4的MTA−/−给小鼠灌胃在体外在控制条件下，然后Pam三CSK公司4（1微克/毫升）(A类)或LTA（1μg/ml）(B类)添加到镀液中并从镀液中去除。JHCO公司三−、数据点、线和第页值如图1所示。平均值在“结果”下给出
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