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.2012年5月1日；72(9):2275-84.
doi:10.1158/0008-5472.CAN-11-3159。 Epub 2012年3月9日。

SUMO E3-ligase PIAS1调节肿瘤抑制因子PML及其致癌对应物PML-RARA

安德烈亚·拉贝利诺 1, 布兰登·卡特, 乔治亚州康斯坦蒂尼杜, 吴淑媛, 亚历山德罗·里梅西, 劳伦再见, 约翰·海马赫, 吕克·吉拉德, 蒋成明, 朱莉·特鲁亚·费尔德斯坦, 保罗·斯卡利奥尼码头
附属机构

SUMO E3-ligase PIAS1调节肿瘤抑制因子PML及其致癌对应物PML-RARA

安德烈亚·拉贝利诺等。 癌症研究. .

摘要

泛素类SUMO蛋白共价修饰蛋白质底物并调节其功能性质。在广泛的癌症中，肿瘤抑制因子PML经历由CK2磷酸化引发的泛素介导的降解。在这里，我们报道了SUMO E3-气体抑制剂PIAS1通过其对急性早幼粒细胞白血病（APL）的PML和PML-RARA癌蛋白进行酰化的能力来调节致癌信号。PIAS1介导的PML SUMO化促进CK2相互作用和泛素/蛋白酶体介导的PM L降解，减弱其抑癌功能。此外，PIAS1介导的PML-RARA的SUMO化对三氧化二砷（一种有效的APL处理方法）诱导其降解至关重要。此外，PIAS1抑制消除了三氧化二砷触发APL细胞凋亡的能力。最后，PIAS1对非小细胞肺癌（NSCLC）细胞中PML的降解也至关重要，在NSCLC细胞系和原始标本中PML和PIAS1呈负相关。总之，我们的发现揭示了PIAS1和SUMO化机制在调节致癌网络和白血病治疗反应中的新作用。

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数字

图1
图1
PIAS1和PIASxα与PML相互作用。如图所示，HEK293T（A–B）或H358和H460（C）细胞的（A–C）细胞裂解物通过IP和WB进行分析。（D） BJ成纤维细胞通过IF.PML（绿色）、PIAS1或PIASxα（红色）、PML与PIAS1的共定位或PIASxα（黄色）进行分析。Bar表示5μm。
图2
图2
PIAS1和PIASxα促进PML SUMO化。（A）体外用WB分析SUMO酰化反应。（B） 用指示的表达载体转染HEK293T细胞，并按指示进行IP分析。如图所示转染（C–D）HEK293T细胞，通过组氨酸纯化和WB分析裂解产物。星号表示一个特定的带。
图3
图3
PIAS1促进泛素介导的PML降解。（A） 用环己酰亚胺处理转染的HEK293T细胞并进行WB分析。（B） 用MG132处理转染的HEK293T细胞。IP和WB检测到泛素化FLAG-PML。（C） 用表达PIAS1 shRNAs（分别为sh1和sh2）或扰民对照（Scr）的慢病毒转导NSCLC细胞株，并进行WB分析。（D） 用指示的慢病毒转导NSCLC细胞系，用1μM As处理2O（运行）三24小时，并由WB进行分析。
图4
图4
依赖PIAS1的PML SUMO化促进与CK2的相互作用以及残基S517处PML的磷酸化。（A） 转染的HEK293T细胞通过IP和WB进行分析。（B） 如图所示转染HEK293T细胞并用MG132处理。通过IP和WB检测泛素化的FLAG-PML或FLAG-PML S517。（C–D）转染的HEK293T细胞通过组氨酸纯化进行分析。首先用抗PML（C）抗体检测WB，然后用抗PML-517（D）磷酸胺剥离WB。星号表示一个特定的带。（E） 氨酰化依赖性PML降解模型：PIAS1促进PML氨酰化[1]，进而通过PML S517的磷酸化招募CK2[2]。S517处PML的磷酸化触发PML降解[3]。S=SUMO，P=磷酸化。
图5
图5
PIAS1促进PML-RARA及其As的SUMO化2O（运行）三-依赖性退化。按照指示转染（A–B）HEK293T细胞，然后通过IP和WB进行分析。P/R=PML-RARA。指示与K65或K160处P/R SUMO化相对应的带。（C） 用1μM As处理转染的HEK293T细胞2O（运行）三24小时，并由WB进行分析。（D） 用As处理表达PIAS1 shRNA（sh1和sh2）或打乱shRNA（Scr）的NB4细胞2O（运行）三24小时，并由WB进行分析。（E） 用1μM As处理表达PIAS1特异性（sh）或对照（Scr）shRNA的NB4细胞2O（运行）三用抗PML抗体进行IF分析。Bar表示5μm。（F） 直方图显示As诱导的凋亡百分比2O（运行）三在表达所示shRNAs的NB4细胞中。星号表示统计学意义。
图6
图6
PIAS1促进非小细胞肺癌的肿瘤发生。（A） WB在所示细胞系中检测到PML和PIAS1。（B） 散点图显示非小细胞肺癌细胞系中PIAS1的mRNA表达（Illumina WG6-V3；对数标度）和拷贝数（根据Illumiana Human1M-Duov3 SNP图谱推断）之间的高Pearson相关系数。（C） 代表性原发性NSCLC标本中PML和PIAS1的组织病理学分析（200倍放大）。上一行：（左面板）非小细胞肺癌标本的一个例子，癌细胞中有强烈的核和细胞质PIAS1染色，但基质细胞中没有；（右面板）同一NSCLC的切片显示，癌细胞PML为阴性，而基质细胞为阳性。下一行：（左面板）非小细胞肺癌样本显示癌细胞中缺乏PIAS1；（右面板）同一NSCLC的一部分显示，在该样本中，PML很容易检测到。插入显示较高的放大倍数。黑色虚线：癌细胞的代表区域。红色虚线：基质细胞的代表区域。（D） 直方图显示了非小细胞肺癌原始标本中PML和PIAS1染色的分布。Y轴：肿瘤数量；X轴：PIAS1和PML染色强度。（E） 直方图显示了在指定时间用紫外线处理并用表达对照shRNA（Scr）或PIAS1 shRNA（sh）的慢病毒转导的细胞中的凋亡百分比。（F） 稳定表达干扰（Scr）或PIAS1 shRNA（shPIAS1）的H1299细胞的增殖，该干扰或PIAS1shRNA转染了抗PML的siRNA（siPML）或控制非靶向siRNA（siCtrl）。右侧显示了用结晶紫染色的代表性组织培养孔。
图7
图7
PIAS1介导的PML和PML-RARA的SUMO化促进其降解。在癌细胞中（左图），PIAS1导致PML SUMO化，进而招募CK2到PML，促进PML脱基的磷酸化。该事件触发PML泛素介导的降解，导致PML肿瘤抑制功能的丧失和肿瘤发生的促进。CK2和PIAS1相互作用（虚线箭头），因此可能存在第三级PML-CK2-PIAS1蛋白复合物。作为2O（运行）三促进PIAS1介导的PML的SUMO化和RNF4泛素E3-ligase的SUMOylated PML的招募。目前尚不清楚RNF4是否介导未接触As的癌细胞中PML的泛素化2O（运行）三在APL（右侧面板）中，PIAS1促进PML-RARA的SUMO化，在缺乏As的情况下2O（运行）三不足以触发PML-RARA的泛素化。作为2O（运行）三促进了PIAS1介导的PML-RARA的SUMO化，导致RNF4泛素E3-酶的SUMOL化PML-RANA的招募。目前尚不清楚调节RNF4向磺胺酰化PML或PML-RARA招募的机制。
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