DYRK2 priming phosphorylation of c-Jun and c-Myc modulates cell cycle progression in human cancer cells

doi:10.1172/JCI60818

.2012年3月；122(3):859-72.

doi:10.11172/JCI60818。 Epub 2012年2月6日。

DYRK2启动c-Jun和c-Myc的磷酸化调节人类癌细胞的细胞周期进展

内奥·泰拉¹, 瑞·米莫托（Rei Mimoto）, 森藤由纪夫, 山口友子, 北川Masanobu, 美木义雄, 吉田清雄

附属公司

PMID： 22307329
预防性维修识别码：项目编号3287383
内政部： 10.1172/JCI60818

DYRK2启动c-Jun和c-Myc的磷酸化调节人类癌细胞的细胞周期进程

内奥·泰拉等。临床研究杂志. 2012年3月.

.2012年3月；122(3):859-72.

doi:10.11172/JCI60818。 Epub 2012年2月6日。

作者

内奥·泰拉¹, 瑞·米莫托（Rei Mimoto）, 森藤由纪夫, 山口友子, 北川Masanobu, 美木义雄, 吉田清雄

附属

¹日本东京医学和牙科大学医学研究所分子遗传学系。

PMID： 22307329
预防性维修识别码：项目编号3287383
内政部： 10.1172/JCI60818

摘要

细胞周期中G（1）/S转换的失调有助于肿瘤的发展。致癌转录因子c-Jun和c-Myc是这一转变过程中不可或缺的调节因子，它们的异常表达与许多恶性肿瘤有关。c-Jun/c-Myc的降解是G（1）/S转换的一个关键过程，该转换由糖原合成酶激酶3β（GSK3β）磷酸化启动。然而，在GSK3β修饰之前，负责启动磷酸化事件的一个或多个特定激酶尚未明确确定。在这里，我们发现双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶DYRK2作为c-Jun和c-Myc的启动激酶发挥作用。由于c-Jun和c-Myc逃避泛素介导的降解，DYRK2在人类癌细胞中的敲除缩短了G（1）期并加速了细胞增殖。与这些结果一致，沉默DYRK2增加了人类癌细胞的细胞增殖，并且这种促进完全被体内c-Jun或c-Myc的共剥夺所阻碍。我们还发现DYRK2在多个人类肿瘤样本中的表达显著减弱。DYRK2的下调与高水平的非磷酸化c-Jun和c-Myc相关，重要的是，与人类乳腺癌的侵袭性相关。这些结果表明，DYRK2通过调节c-Jun和c-Myc调节肿瘤进展。

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数字

**图1。DYRK2的沉默通过上调c-Jun和c-Myc导致过度增殖。**
(A类)用打乱的siRNA或DYRK2-特异性siRNA转染HeLa细胞。转染后，进行集落形成分析。用抗DYRK2或抗管蛋白免疫印迹细胞裂解物。使用RT-PCR分析总RNADYRK2型-特定或*GAPDH公司*-特异性引物。(B类)用打乱的siRNA或DYRK2 siRNA转染HeLa细胞，用台盼蓝排斥法分析细胞生长。(C类和D类)用打乱的siRNA或DYRK2 siRNA转染HeLa细胞，转染后用碘化丙啶染色，用流式细胞仪分析细胞周期***P（P）*< 0.01. (E类)用抗c-Jun（上图）、抗c-Myc（第二图）或抗微管蛋白（第三图）转染HeLa细胞并通过免疫印迹（IB）进行分析。总RNA用*c-6月*–特定（第4和第8面板），*c-Myc基因*-特定（第5和第9面板），*DYRK2型*-特定（第6和第10面板），或*GAPDH公司*-特异性（第7组）引物。定量RT-PCR的结果标准化为*GAPDH公司*并表示与对照样品相比的相对折叠诱导。数据从3个独立的实验中进行评估，每个实验均一式三份。数据表示平均值±标准偏差。qRT-PCR，定量RT-PCR。

**图2。DYRK2在启动磷酸化残基处磷酸化c-Jun和c-Myc。**
(A类)c-Myc和c-Jun磷酸化残基的序列比对(B类)重组DYRK2与GST孵育–c-Jun_210–310或GST–c-Myc_1–100在ATP在场的情况下。通过免疫印迹法分析反应物，包括抗磷酸化c-Jun（Ser243）（左上面板）、抗磷酸化-c-Myc（Ser62）（右上面板），抗-His（中面板）或抗GST（下面板）。(C类)293T细胞与GFP载体、GFP-DYRK2 WT或GFP-DYRK2-KR以及标记的c-Jun（Flag–c-Jun）或c-Myc（Flag-c-Myc）共同转染。用抗病毒琼脂糖免疫沉淀裂解液。然后用抗磷酸化c-Jun（Ser243）（左上面板）、抗磷酸化c-Myc（Thr58/Ser62）（右上面板）或抗Flag（第二面板）对免疫沉淀物进行免疫印迹分析。还用抗-Flag（第三幅）、抗-GFP（第四幅）或抗微管蛋白（下图）对裂解物进行免疫印迹分析。(D类)重组DYRK2和/或His-GSK3β与GST–c-Jun孵育_210–310或GST–c-Myc_1–100用所示抗体分析反应产物。

**图3。DYRK2调节c-Jun和c-Myc的稳定性。**
(A类)用打乱的siRNA或DYRK2 siRNA转染U2OS细胞。转染后，细胞与40μg/ml CHX孵育指定时间。用抗c-Jun、抗c-Myc或抗管蛋白免疫印迹法分析裂解产物。扫描c-Jun（左）或c-Myc（右）的信号，以比较对照组的剂量（时间0）**P（P）*< 0.05. 数据表示平均值±标准偏差(B类)用打乱的siRNA或DYRK2 siRNA转染U2OS细胞，并与10μM MG-132孵育4小时。用兔IgG、抗c-Jun或抗c-Myc对裂解物进行免疫沉淀，然后用抗泛素、抗c-Jun或抗c-Myc进行免疫印迹。用所示抗体对裂解液进行免疫印迹分析（右侧面板）。(C类)用打乱的siRNA、DYRK2 siRNA或Fbw7 siRNA转染U2OS细胞。用抗c-Jun、抗c-Myc或抗管蛋白免疫印迹裂解产物。白线分隔的车道在同一凝胶上行驶，但并不相邻。使用RT-PCR分析总RNADYRK2型-具体而言，*飞行重量7*-特定，或*肌动蛋白*-特异性引物。

**图4。G₁/DYRK2-不完全细胞中S转变加速。**
(A类)用打乱的siRNA或DYRK2 siRNA转染U2OS细胞，然后在指定的时间内进行血清饥饿和刺激。用所示抗体对裂解液进行免疫印迹分析。(B类)Fucci系统示意图。(C类)用打乱的siRNA或DYRK2 siRNA转染Fucci表达的HeLa细胞。将培养基改为含有0.25%血清的DMEM。用血清重新喂养后，对细胞进行延时荧光显微镜检查。(D类)用干扰siRNA、DYRK2 siRNA、c-Jun特异siRNA或c-Myc特异siRNA转染U2OS细胞。转染后，细胞进行MTS分析（上面板）或集落形成分析（下面板）。(E类)U2OS细胞与干扰siRNA或DYRK2 siRNA和Flag–c-Myc WT或Flag-c-Myc T58A/S62A共同转染。转染后，对细胞进行MTS分析（上面板）或集落形成分析（下面板）。数据表示平均值±标准偏差。

**图5。DYRK2的稳定敲除可在体内外促进肿瘤生长。**
(A类)用pSuper载体或pSuper-DYRK2 shRNA转染MCF-7细胞。为了分离稳定的shRNA表达细胞，用嘌呤霉素筛选转染细胞。通过定量RT-PCR监测DYRK2的敲除效率。(B类)用所示抗体进行免疫印迹分析稳定表达载体（载体）或pSuper DYRK2 shRNA（DYRK1 shRNA#7）的MCF-7细胞裂解物。通过RT-PCR分析总RNA。定量RT-PCR的结果标准化为*肌动蛋白*并表示与对照样品相比的相对折叠诱导。数据从3个独立的实验中进行评估，每个实验均一式三份。(C类和D类)通过MTS分析分析细胞生长(C类)或菌落形成试验(D类). (E类和F类)将转导的含有50%基质凝胶的MCF-7细胞接种到植入17β-雌二醇片的BALB/c nu/nu小鼠腹部乳腺的泌乳管开口处。用卡尺测量肿瘤大小(n个= 3). 数据（最大肿瘤体积[MTV]）表示平均值±SD(E类). **P（P）*< 0.05. 接种后10周拍摄的荷瘤裸鼠（上图）和肿瘤（下图）的代表性照片(F类). 箭头表示接种了肿瘤。比例尺：10 mm(**G公司**)用抗DYRK2、抗c-Jun或抗c-Myc对去核肿瘤进行免疫染色。比例尺：50μm。

**图6。DYRK2在各种人类肿瘤组织中的下调。**
使用多个癌组织和相应的正常组织微阵列进行抗DYRK2的免疫组织化学染色。比例尺：200μm。

**图7。DYRK2失活与c-Jun/c-Myc磷酸化受损以及人类乳腺癌的侵袭性有关。**
(A类)乳腺癌标本中DYRK2蛋白的代表性免疫组化染色（左幅）。比例尺：500μm。左面板（右面板）显示了正常组织和浸润性乳腺导管癌的边界示意图。(B类)侵袭性乳腺癌中DYRK2表达水平与c-Jun/c-Myc磷酸化状态的相互分析。显示了抗DYRK2、抗磷酸化c-Jun（Ser243）和抗磷酸化-c-Myc（Ser62）的代表性免疫组织化学染色。比例尺：150μm。

**图8。DYRK2介导的细胞周期调控模型。**
(A类)晚些时候₁相，c-Myc和c-Jun被DYRK2磷酸化，DYRK2作为GSK3β结合的启动位点。然后，GSK3β通过启动磷酸化识别获得磷酸化（P）c-Jun和c-Myc的许可。磷酸化c-Jun和c-Myc结合泛素连接酶降解。(B类)在缺乏DYRK2的情况下，GSK3β无法磷酸化c-Jun和c-Myc。未磷酸化的c-Jun和c-Myc逃避泛素介导的蛋白酶体降解。c-Jun和c-Myc的积累诱导其靶基因，如cyclin E。

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[10] Krek W.蛋白质水解和G1-S转换：SCF连接。1998年通用操作基因开发；8(1):36–42. doi:10.1016/S0959-437X（98）80059-2。-内政部-公共医学

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