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.2011年12月30日；286(52):44750-63.
doi:10.1074/jbc。M111.250894。 Epub 2011年11月7日。

核因子κB亚单位RelB和cRel通过诱导转录抑制蛋白YY1负调控Toll样受体3介导的β-干扰素的产生

Jakub Siednienko先生 1, 阿什维尼·马拉塔, 朔阳, 马尔戈扎塔·米奇维茨, Sinéad M Miggin先生, 保罗·莫纳
附属公司

核因子κB亚单位RelB和cRel通过诱导转录抑制蛋白YY1负调控Toll样受体3介导的β-干扰素的产生

雅库布·西德尼恩科等。 生物化学杂志. .

摘要

β-干扰素（IFN-β）的诱导是RNA病毒感染的关键抗病毒反应。病毒诱导的IFN-β表达需要转录因子IRF-3/7、NF-κB和ATF-2/c-Jun对IFN-β启动子的协同作用，导致染色质重塑复合物的有序募集。尽管病毒强烈激活NF-κB并促进其与干扰素-β启动子的结合，但最近的研究表明，NFκB对病毒诱导的干扰素β表达并不必要。在此，我们研究了NF-κB在调节干扰素β表达以响应病毒感应Toll-like受体3（TLR3）中的作用。NF-κB通路的有趣药理抑制增强了IFN-β表达的晚期表达，以响应TLR3刺激。我们表明，NF-κB对IFN-β表达的负作用依赖于转录抑制蛋白YinYang1的诱导。我们证明TLR3配体聚核糖核酸肌苷：聚核糖胞苷酸（poly（I:C））诱导银阳1的表达和核转位，其中它与IFN-β启动子相互作用，并抑制IRF7与后者的结合。也有证据表明，NF-κB亚单位c-Rel和RelB可能是这些对IFN-β表达的负面影响的关键驱动因素。因此，这些发现首次强调了TLR3用于限制IFN-β表达水平和持续时间的新型自我调节机制。

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数字

图1。
图1。
抑制NF-κB增强poly（I:C）诱导的IFN-β的表达。野生型（WT）和TRIF的不朽BMDM−/−老鼠(A类和B类)和M-CSF分化的THP-1细胞(C类)使用或不使用NF-κB抑制剂JSH-23（30μ米)持续30分钟，然后在不存在或存在聚（I:C）（1μg/ml）或LPS（10 ng/ml）的情况下进一步刺激2小时。E类，U373细胞先前转染了编码IκB超阻遏物的表达结构(SR公司)蛋白或肾素荧光素酶蛋白作为对照。分离总RNA，将其转化为第一链cDNA，并用作定量实时RT-PCR的模板，以测定(A类,C类、和E类)IFN-β和(B类和C类)肿瘤坏死因子α。相关mRNA的水平相对于看家基因HPRT进行了归一化，并相对于非刺激细胞的归一化值进行了表达。天用JSH-23（30μ米)在用poly（I:C）（10μg/ml）刺激16 h之前，持续1 h。随后用夹心ELISA法检测细胞上清液中的IFN-β蛋白水平。所有数据均表示三个独立实验的平均值±S.E.，并对未配对学生的t吨测试，*，第页< 0.05; **,第页< 0.01.
图2。
图2。
NF-κB通过YY1的诱导负调控TLR3诱导的IFN-β表达。 A–C，BMDM接受或不接受NF-κB抑制剂JSH-23（30μ米)和/或环己酰胺(循环。，10μg/ml），持续30分钟，然后在不存在或存在聚（I:C）（1μg/ml）或LPS（10 ng/ml）的情况下进一步刺激2小时(A类和B类)或90分钟(C类). 分离总RNA，转化为第一链cDNA，并用作定量RT-PCR的模板，以检测IFN-βmRNA的表达水平(A类和B类)和YY1(C类). 相关mRNA的水平相对于看家基因HPRT进行了归一化，并相对于非刺激细胞的归一化值进行了表达。天用慢病毒编码控制或mYY1-特异性shRNA转导BMDM。然后用poly（I:C）（1μg/ml）或LPS（10 ng/ml）刺激细胞2 h。生成cDNA，并用半定量PCR检测YY1的表达(插入)以及通过定量RT-PCR进行IFN-β表达，如上所述。E类，U373细胞转染对照组(控制)或YY1-特异性siRNA，并允许恢复36 h。然后用或不用JSH-23（30μ米)持续30分钟，然后在不存在或存在poly（I:C）（1μg/ml）的情况下进一步刺激2小时。生成cDNA，并通过定量RT-PCR分析IFN-β的表达。使用抗YY1抗体通过Western blotting检测细胞裂解物(插入). 所有数据均表示三个独立实验的平均值±S.E.，并对未配对学生的t吨测试*，第页< 0.05; **,第页< 0.01.
图3。
图3。
TLR3信号激活RelB和c-Rel，但不激活RelA。 A类，BMDM用poly（I:C）（1μg/ml）或LPS（10 ng/ml）处理指定时间。生成细胞裂解物并通过Western blotting评估IκBα、磷酸化JNK、磷酸化p38 MAPK和β-肌动蛋白的水平。B–D类，U373细胞生长在玻璃盖玻片上，用poly（I:C）（10μg/ml）处理60和90分钟。固定细胞并用抗RelA抗体检测其免疫反应性(B类)，抗RelB(C类)和反cRel(天)抗体。使用Alexa Fluor 633标记的二级抗体通过共焦显微镜观察免疫反应性。细胞核的DAPI染色也包括在内。共焦图像是使用配备适当滤光片组的奥林巴斯FluoView FV1000系统激光扫描显微镜拍摄的。使用Olympus FV 1.6b成像软件进行数据分析。为了清晰起见，显示了单个细胞图像，覆盖面板中的数字表示在较大区域内的细胞群体中观察到的细胞定位频率。
图4。
图4。
RelB和c-Rel负调节TLR3诱导的IFN-β表达。 A类和C–E类，HEK293-TLR3细胞与编码IFN-β启动子的质粒构建物共转染(A类)-，PRDI-III(C类)-，PRDII公司(天)-或PRDIV(E类)-调节的萤火虫荧光素酶（80 ng）、组成性表达的TK Renilla荧光素酶（20 ng）以及编码RelA、c-Rel、RelB和YY1的不同数量的表达结构体（1、10和20 ng）。细胞恢复16小时，然后用poly（I:C）（1μg/ml）刺激6小时。生成细胞裂解物并分析萤火虫荧光素酶活性，并使用雷尼利亚荧光素酶活性。数据显示为相对于未刺激细胞的萤火虫荧光素酶表达的倍刺激。B类U373生长在12孔板上，并转染编码RelA、c-Rel和RelB（300、600、900 ng）的质粒构建物。细胞恢复16小时，然后用poly（I:C）（1μg/ml）刺激16小时。用夹心ELISA法检测细胞上清液中的干扰素-β蛋白水平。数据表示来自三个独立实验的三次重复测定的平均值±S.Et吨测试；*，第页< 0.05; **,第页与之前在没有Rel表达结构的情况下转染的聚（I:C）刺激细胞相比，<0.01。
图5。
图5。
YY1在TLR3刺激下表现出核定位，并负调控IFN-β启动子的PRDI/III结构域。 A类U373细胞在玻璃盖玻片上生长，并用poly（I:C）（10μg/ml）处理不同时间。固定细胞并用抗YY1抗体检测免疫反应。使用Alexa Fluor 633标记的二级抗体通过共焦显微镜观察免疫反应性。细胞核的DAPI染色也包括在内。共焦图像是使用配备适当滤光片组的奥林巴斯FluoView FV1000系统激光扫描显微镜拍摄的。使用Olympus FV 1.6b成像软件进行数据分析。为了清晰起见，显示了单个细胞图像覆盖面板中的数字指示在更大范围内的细胞群体中观察到的细胞定位频率。B类U373细胞转染不同数量（300或600 ng）编码YY1或GFP的表达质粒作为对照。转染后24 h，用poly（I:C）（10μg/ml）处理细胞2 h。分离总RNA，转化为第一链cDNA，并用作定量实时RT-PCR模板，测定IFN-β和IL-6的mRNA表达水平。mRNAs的水平相对于看家基因HPRT进行了标准化，并相对于非刺激细胞的标准化值进行了表达。C类和天，HEK293-TLR3细胞与编码Trif（20 ng）、YY1（10，20 ng），组成性表达的TK Renilla荧光素酶（20 ng。天，HEK293-TLR3细胞也转染了对照和YY1-特异性siRNA。细胞恢复24小时，然后分析细胞裂解物的萤火虫荧光素酶活性，并使用雷尼利亚荧光素酶活性。数据以萤火虫萤光素酶表达相对于未转染Trif但转染空载体的细胞的倍刺激的形式呈现(电动汽车)构造。通过产生cDNA并使用半定量PCR分析YY1和HPRT表达的不同稀释液，确认YY1基因敲除(插入在里面面板D). 数据表示来自三个独立实验的三次重复测定的平均值±S.Et吨测试*，第页< 0.05; **,第页< 0.01.RLU（RLU），相对荧光素酶单位。
图6。
图6。
YY1抑制IFN-β启动子处IRF7的结合和激活。 A类和B类，HEK293-TLR3细胞与编码IRF3（10 ng(A类))或IRF7（10 ng(B类))和Trif（10 ng）、YY1（10，20 ng），组成性表达的TK Renilla荧光素酶（20 ng）和IFN-β启动子-、PRDI-III、PRDII-或PRDIV调节的萤火虫荧光素酶（80 ng）。细胞恢复24小时，然后分析细胞裂解物的萤火虫荧光素酶活性，并使用雷尼利亚荧光素酶活性。数据显示为相对于未经Trif转染的细胞的萤火虫荧光素酶表达的倍刺激。数据表示三个独立实验的三次测定的平均值±S.E.，并接受未配对的Student’St吨测试*，第页< 0.05; **,第页<0.01。C和天，用编码HA-标记的YY1的表达质粒转染HEK293-TLR3细胞，转染时分别带有和不带有FLAG-标记的IRF7。允许细胞恢复16 h，然后用或不用（对照）poly（I:C）（10μg/ml）刺激指定时间。制备核提取物，并使用链霉亲和素磁珠和与IFN-β启动子的增强子序列相对应的生物素化寡核苷酸进行亲和沉淀。在不含寡核苷酸的情况下用磁珠沉淀作为检测的阴性对照。使用抗α-微管蛋白、组蛋白H3、HA和FLAG抗体对核提取物和增强体沉淀物进行Western blotting。这些数据代表了两个独立的实验。天，增强体沉淀物中IRF7的水平通过密度分析进行定量，并相对于相应核提取物中组蛋白H3的水平进行表达。E类用JSH-23（30μ米)30分钟，然后在没有或存在聚（I:C）（10μg/ml）的情况下刺激4小时。细胞固定在甲醛中，然后进行细胞核分离和超声处理。用抗YY1或抗IRF7或兔IgG对照抗体免疫沉淀超声核裂解物。输入DNA（免疫沉淀前）和免疫沉淀染色质分别通过20或35个PCR周期进行分析，设计引物扩增IFN-β启动子的一个区域。
图7。
图7。
IRF7介导poly（I:C），但不介导LPS诱导的IFN-β表达。 A类，U373细胞用poly（I:C）（10μg/ml）或LPS（100 ng/ml）处理指定时间。生成核提取物，并通过Western blotting评估IRF7和RelA水平。B类HEK293-TLR3和HEK293-TLR4细胞与编码PRDI-III调节的萤火虫荧光素酶（80 ng）、组成性表达的TK Renilla荧光素酶（20 ng）和编码YY1的不同数量的表达结构体（1、10、20 ng）的质粒结构体共转染。转染的HEK293-TLR3和HEK293-TLR4细胞恢复16 h，然后分别用poly（I:C）（1μg/ml）或LPS（10 ng/ml）刺激6 h。生成细胞裂解物并分析萤火虫荧光素酶活性，并使用雷尼利亚荧光素酶活性。数据显示为相对于未刺激细胞的萤火虫荧光素酶表达的倍刺激。C类，用慢病毒编码对照或IRF7特异性shRNA转导BMDM。然后用poly（I:C）（1μg/ml）或LPS（10ng/ml）刺激细胞2小时。产生cDNA，并使用半定量PCR检测IRF7和HPRT的表达(插入)并通过定量RT-PCR检测IFN-β的表达。IFN-β表达水平相对于未刺激(控制)用对照shRNA转导的细胞。
图8。
图8。
TLR3信号通路中YY1诱导后抑制IFN-β表达的示意图。TLR3与dsRNA配体结合(例如poly（I:C）促进TRIF/TBK1/诱导型IκB激酶途径的激活，导致IRF3和IRF7结合到IFN-β启动子的PRD I/III结构域。这导致了干扰素-β基因。TLR3是经典NF-κB途径（尤其是p65）的弱激活剂，但能强烈刺激Rel亚基RelB和c-Rel的核转位，然后诱导YY1。后者根据TLR3信号转位到细胞核，将IRF7从IFN-β启动子中置换出来，导致诱导后抑制IFN-β表达。
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