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.2011年11月1日；30(23):4777-89.
doi:10.1038/emboj.2011.393。

Smurf2的消融揭示了通过Smad3的多重单泛素化抑制TGF-β信号传导

刘亚堂 1, 山下本子, 内森·库森, 一汤, 王向春, 李翠玲, Chu Xia Deng先生, 史蒂文·Y·程, 张颖娥
附属公司

Smurf2的消融揭示了通过Smad3的多重单泛素化抑制TGF-β信号传导

刘亚堂等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

TGF-β信号传导受Smad蛋白翻译后修饰的调节，以将配体浓度的定量差异转化为成比例的转录输出。先前在细胞培养系统中的研究表明，Smad泛素化调节因子（Smurfs）通过靶向Smad进行蛋白酶体降解来发挥这种调节作用，但这种机制是否在生理条件下起作用尚不清楚。在这里，我们培育出含有靶向突变的Smurf2等位基因的小鼠。使用原代小鼠胚胎成纤维细胞和皮肤成纤维细胞，我们发现TGF-β介导的Smad依赖性转录反应在缺乏Smurf2的情况下升高。我们证明，Smurf2实际上诱导体内Smad3的多重单体泛素化，而不是促进多体泛素和降解。紧邻Smad3 PY基序上游的T179的磷酸化增强了Smurf2和Smad3的相互作用以及Smad3泛素化。我们已经将Smurf2诱导的Smad3泛素化位点映射到MH2结构域的赖氨酸残基，并证明Smad3的泛素化抑制Smad3复合物的形成。因此，我们的数据支持一种模型，即Smurf2通过减弱Smad3的活性而不是促进其降解来负向调节TGF-β信号。

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数字

图1
图1
具有靶向突变Smurf2等位基因的小鼠发育正常。(A类)Smurf2基因座和靶向结构的示意图。N、，不是我；X、，Xho公司我；H、，血红蛋白我；B、，巴姆你好。(B类)Smurf2域映射的图示。(C类)Southern blot显示WT和靶向Smurf2等位基因。5′外部探头如所示(A类). (D类)Smurf2等位基因的PCR基因分型。(E类)少数孤立椎体畸形的X线图像蓝色2−/−老鼠。上面板：环形尾翼；底部面板：扭结的尾巴。(F类)a的外观蓝色2−/−脑积水小鼠。
图2
图2
TGF-β/Smad转录反应升高蓝色2−/−细胞。(A类)（复合年增长率）12-Luc和(B类)WT和蓝色2−/−（KO）MEF。使用SB431542去除所有TGF-β活化（–TGF-？）。内源性PAI-1的量化(C类)CTGF公司(D类)，c-6月(E类)，或Smad7(F类)实时PCR检测WT和KO真皮成纤维细胞的mRNA水平。HPRT转录水平用作标准化的内部控制，结果以相对表达±标准差表示。
图3
图3
Smurf2的缺失不影响Smad2/3或TGF-β诱导的磷酸化的蛋白质稳定性。(A类)Western blot分析和(B类)环己酰亚胺（CHX）和TGF-β处理后MEF中TβRI、TβRII、Smad2和Smad3转换的定量。数据收集自两个不同的实验，使用从两个不同窝中制备的初级MEF。(C类)Smad2/3磷酸化对TGF-β刺激反应的时间进程。图源数据可以通过补充信息找到。
图4
图4
Smurf2诱导Smad3的多重单泛素化。(A类)Smad3泛素化需要Smurf2。从转染的MEF中免疫沉淀总Flag–Smad3，并通过SDS–PAGE进行解析。Western blot分析检测沉淀物中的HA–泛素（顶部）和Flag–Smad3（中间两个面板）。还分析了全细胞裂解物中总HA–Ub、Flag–Smad3和内源性Smurf2的水平，并显示在底部面板中。(B类)Smurf2的缺失对Smad2的泛素化几乎没有影响，这与(A类). (C类)蓝精灵2诱导Smad3的单泛素化。Flag–Smad3分析如下(A类)除HA–Ub（KO）（左面板）或HA–UbK48R和HA–Ub-K63R（右面板）用于联合转染外。星号表示标志–Smad3。(D类)Smurf2的E3连接酶和Smad3的PY基序都是Smurf2诱导Smad3单泛素化所必需的。WT-Myc–Smurf2和Flag–Smad3及其突变体Myc–Smurf2（CG）和Flag-Smad3ΔPY与HA–Ub一起转染到MEF中。在TGF-β处理1h和免疫沉淀后，通过IP-western blot分析这些蛋白。注意，内源性Smad3的T179在TGF-β的作用下被磷酸化，而外源性Flag–Smad3 T179的磷酸化基础水平较高。(E类)Smurf2对Flag-Smad2的泛素化仅表现出轻微的影响，其分析与(D类). (F类)在含有ATP、纯化E1、E2和重组His的重组系统中，从转染HEK293细胞中分离的Flag–Smad3的泛素化6-Smurf2或-Smurf2CG。反应在37°C下进行1小时(克)WT-MEF内源性Smad3泛素修饰模式。图源数据可以通过补充信息找到。
图5
图5
连接体区域中T179的磷酸化是Smad3结合Smurf2所必需的。(A类)IP-western blot分析各种Smad3突变体在转染HEK293细胞中结合Smurf2的能力。EPSM、Smad3突变体具有所有四个磷酸化位点（T179、S204、S208和S213）突变。(B类)In-vitro公司肽结合分析显示Smurf2结合需要磷酸化。(C类)ITC分析Smurf2和Smad2/3肽的WW2–WW3片段之间的结合亲和力。(D类)WT MEF中Smad3 T179突变体泛素化的IP-western blot分析。(E类)免疫印迹分析Smad3在WT或WT中C末端磷酸化位点突变体的泛素化蓝精灵2−/−MEF公司。图源数据可以通过补充信息找到。
图6
图6
Smad3在C末端（MH2）结构域泛素化。(A类)Smad3结构的示意图。四种潜在的Ub受体赖氨酸表示为A、B、C或D(B类)不同Smad3片段的IP-western blot分析蓝色2−/−MEF公司。FL，全长Smad3；N、 MH1结构域；NL，MH1域+连接区；LC，连接区+MH2结构域；C、 MH2域。(C类)中C末端Ub受体位点赖氨酸突变体的IP-western blot分析蓝色2−/−MEF公司。箭头表示双单双组分Smad3。图源数据可以通过补充信息找到。
图7
图7
Smad3的单泛素化使Smad复合物不稳定。(A类)Smurf2缺失增强内源性Smad3/Smad4异聚物的形成。在进行IP-western blot分析之前，将MEF处理为±TGF-β1 h。(B类)将Smurf2重新引入蓝色2−/−MEF干扰外源性Smad3/Smad4复合物。星号表示内源性磷酸化Smad3，箭头表示外源性磷酸化的Smad3。注意，三重和四重突变体在受体激活和Smad4相互作用方面存在缺陷。(C类)将Smurf2重新引入蓝色2−/−MEF减少外源Smad3同质复合物的形成。注意，在没有或存在Smurf2和HA–Ub或ΔPY突变的情况下，抗Flag IP降低的Smad3（GFP）量的变化。(D类)GST下拉分析表明，单-泛素化Smad3不与纯化的Smad4或磷酸化Smad2结合。从转染的HEK293细胞制备泛素化和非泛素化Smad3SD的1:1混合物，并分别与GST、GST–Smad4或磷酸化GST–Smad3孵育，然后进行GST下拉和蛋白质印迹分析。图源数据可以通过补充信息找到。
图8
图8
Smurf2缺失增加Smad3的核积累。(A类)内源性Smad3的间接免疫荧光染色。MEF预处理±TGF-β1 h，然后去除配体并用SB431542阻断受体，持续指定时间。(B类)荧光强度的量化(A类). 结果表示为细胞核和细胞质染色的平均荧光强度之比。条形图表示平均值±标准差，以及n个每种情况下=30。(C类)磷酸-Smad2/3的Western blot分析显示WT和KO MEF之间的去磷酸化动力学相似。TGF-β和SB431542处理与(A类). (D类)Smurf2通过Smad3单泛素化在TGF-β信号传导中抑制功能的模型。在TGF-β刺激下，Smad3在接头和C末端区域的位点被磷酸化。连接区T179的磷酸化增强了Smurf2结合以及随后在MH2结构域中的单-泛素化。这种单-泛素化阻碍异三聚体和同三聚体Smad3复合物的形成，从而抑制TGF-β信号的振幅。图源数据可以通过补充信息找到。
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