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.2011年8月26日；30(19):4059-70.
doi:10.1038/emboj.2011.285。

RUNX1通过调节与远端调节元件的相互作用调节造血干细胞中的CD34基因

埃琳娜·莱万蒂尼 1, 桑勋·李, 汉娜·拉多姆斯卡, 克里斯托弗·海瑟林顿, Meritxell Alberich-Jorda公司, 乔瓦尼·阿马比尔, Pu Zhang先生, 大卫·A·冈萨雷斯, 张俊彦（Junyan Zhang）, 丹妮拉·巴塞雷斯, 尼古拉·威尔逊, 斯特芬·科什米德, 黄刚（Gang Huang）, 张冬儿, 亚历山大·埃布拉利泽, Constanze Bonifer公司, Yutaka Okuno公司, 伯蒂·戈特根斯, 丹尼尔·特南
附属公司

RUNX1通过调节与远端调节元件的相互作用调节造血干细胞中的CD34基因

埃琳娜·列文蒂尼等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

转录因子RUNX1对建立造血基因表达程序至关重要；然而，它如何激活造血干细胞（HSC）基因转录的机制尚不清楚。在这里，我们通过研究HSC中表达的人CD34基因的调控，获得了对RUNX1功能的新见解。使用携带人CD34-PAC构建体的转基因小鼠，我们鉴定了一种新的下游调节元件（DRE），它与RUNX1结合，是人CD34在长期（LT）-HSC中表达所必需的。携带人CD34启动子-DRE构建物的小鼠中Runx1的条件性缺失可消除人CD34的表达。我们通过LT-HSC中的染色体构象捕获分析证明DRE与人类CD34启动子发生物理相互作用。RUNX结合位点的靶向突变导致这种相互作用受到干扰，并降低了LT-HSC中人CD34的表达。总之，我们的体内数据为RUNX1在介导HSC基因CD34远端和近端元件之间的相互作用中的作用提供了新的证据。

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数字

图1
图1
位于人类+17.4 kb和+19.6 kb之间的基因组区域CD34型该基因在SLAM中的表达是必需的+LSK。(A类)人体示意图CD34型转基因小鼠中使用的基因组片段。所有片段（A–C）均来自PAC54A19，并按照指示进行消化。粗竖线表示八个hCD34型编码外显子。(B)对携带A–C结构体转基因小鼠的骨髓细胞进行流式细胞术。用抗鼠c-kit和sca-1抗体对细胞进行染色，以鉴定LSK（谱系−; Sca1型+; 和c-kit+人口），如左面板所示；使用抗小鼠CD48和CD150/SLAM抗体来鉴定CD150单一阳性人群（SLAM+电池）包含在LSK隔间内，如中间面板所示；用抗hCD34抗体定量hCD34的数量+SLAM中包含的单元格+人口（右侧面板）。记录了封闭种群的百分比。所有图都显示了来自三个不同转基因系中每一个的代表性实例。吨-测试（双尾；类型3）表明，从构建体A的三个独立转基因系中获得的数据(n个=每位创办人3人，其中一部分来自一位创办人，我们没有观察到种系转基因传播），在统计上没有差异(P（P）=0.55）从8只用于构建B的独立转基因小鼠中观察到的百分比(n个=每位创始人3名，其中1名创始人的部分没有显示生殖系传播），但在统计上有所不同(P（P）=2.2，E−22），来自结构体C的三个独立转基因系(n个=每位创始人3人）。(C类)生物信息学进行序列分析以确定2.2kb基因组区域中包含的感兴趣区域，该区域跨越+17.4和+19.6kb。最大的3′0.8 kb，在这里被确定为下游调控元件（DRE），包含四个RUNX位点和两个E-Box/GATA基序。
图2
图2
DRE对人类来说是必要和充分的CD34型SLAM中的表达式+LSK。(A类)修改了结构A（如图1所示），专门删除了DRE（结构D）。(B)如图1所示，通过流式细胞术对携带结构体D的小鼠的骨髓细胞进行了分析。删除DRE就足以废除hCD34型SLAM中的表达式+LSK（右侧面板）。图中显示了三条创建线之一的典型FACS图。吨-试验（双尾；3型）表明，在来自构建体D的三个独立转基因系中获得的数据(n个=每位创始人3人）在统计上存在差异(P（P）=2.8，E−21）。(C类)构建物A的目的是将DRE作为人类的唯一序列3′CD34型基因（构造E）。(D类)携带构建物E小鼠骨髓细胞的流式细胞术。DRE足以作为唯一的3′元素来驱动hCD34型SLAM中的表达式+LSK。图中显示了九条创始人线中的一条代表性FACS曲线。吨-试验（双尾；类型3）表明，在9只转基因小鼠中观察到的构建E的百分比(n个=每个创建者3个，其中一部分来自两个创建者，我们没有观察到生殖系转基因传播），与携带结构体a的小鼠获得的数据没有统计学差异(P（P）=0.15). 另见补充表S1。
图3
图3
RUNX1与DRE中包含的RUNX位点结合。(A类)对原始人类脐血（CB）细胞（>95%hCD34）进行定量ChIP分析+)和HL60细胞（hCD34−). 使用包含RUNX位点1–3和RUNX部位4的引物和探针来扩增输入基因组DNA，以及由针对正常IgG或Runx1或组蛋白3的抗体沉淀的DNA，这些抗体在赖氨酸9和14（aH3-Ac）处乙酰化。Myf5启动子被用作阴性对照序列。将值归一化为输入基因组DNA。该面板显示了使用抗Runx1抗体获得的折叠富集值（脐血的黑色柱▪ 和HL60的虚线列公式图像)与IgG（脐血白色柱□HL60的斜杆柱公式图像)，用作阴性对照。如图所示，获得的脐带血细胞中倍数富集的值在统计学上是不同的（条形表示标准偏差）。(B)该面板显示了抗aH3-Ac抗体（脐血黑柱）获得的折叠富集值▪ 和HL60的虚线列公式图像)；IgG（脐血白色柱□HL60的斜杆柱公式图像)作为检测特异性的对照。如图所示，脐血细胞的折叠富集值在统计学上有所不同。所有数据都代表了三个独立的重复实验。另请参见补充图S1。
图4
图4
RUNX1调节人类CD34型SLAM中的表达式+LSK。(A类)用于获取的繁殖策略示意图hCD34型+老鼠(hCD34型18.3kb5′/DRE3′)有条件删除运行x1.hCD34携带构建物E的转基因小鼠被培育成有条件的运行x1敲除（KO）小鼠(运行x1前/后)和Mx1克里小鼠，获得干扰素诱导的运行x1基因切除。小鼠接受了7次PIPC注射，并在1个月后进行了分析。(B)PIPC处理的骨髓细胞流式细胞术分析hCD34型+运行x1WT或hCD34型+运行x1KO小鼠。显示了从一只WT和一只KO鼠标获得的典型FACS图。吨-测试（双尾；类型3）表明hCD34型+运行x1重量(n个=6）具有统计学差异(P（P）=6.7，E−19），根据hCD34型+运行x1KO小鼠(n个=6）。另请参见补充图S2。
图5
图5
DRE与人类互动CD34型SLAM中的促进者+LSK。(A类)显示基因组位置的图表hCD34型启动子（Pr）；八个编码外显子（粗垂直线）；DRE；和位置后面的用于进行3C分析的III（H3）限制性内切酶位点（垂直箭头）。嵌段箭头表示Pr片段（7.4kb）与DRE片段（4.9kb）以及位于DRE上游3′-侧翼区域的其他六个片段的相互作用（嵌段箭头1-6）。每个H3片段与DRE的距离以kb（垂直数字）表示。(B)Pr和DRE以及位于DRE上游的其他6个3′片段的相对交联频率。交联频率表示远端基因组元件相互作用的频率。在HL60细胞（hCD34）中，3′片段和DRE与Pr的相互作用很少见−)而在KG1a细胞（hCD34）中其频率增加+)与hCD34相比，DRE的相对交联频率增加了6.2倍−HL60细胞系(n个=每细胞系4个；两个独立的3C实验）。(C类)在左侧面板上，hCD34中Pr和DRE的相对交联频率+SLAM公司+LSK公司(n个=4; 黑柱；▪) 和hCD34−林+单元格(n个=4; 白柱；□)来自携带结构体A的小鼠，标准化为hCD34中的水平+SLAM公司+表示LSK。在hCD34中DRE和Pr的相互作用很少见−细胞，而在hCD34中观察到10倍的富集+LT HSC。鉴于每只小鼠的HSC数量较少，仅分析了Pr和DRE之间的相对交联频率。在右侧面板上，Q-RT-PCR数据验证了hCD34型在SLAM中+LSK和lin+显示了用于3C分析的细胞。排序SLAM+从总共25只转基因小鼠中收集LSK用于构建a(D类)在左侧面板上，hCD34中Pr和DRE的相对交联频率+脐血细胞(n个=4; 黑柱；▪) 和hCD34−脐血细胞(n个=4；白柱；□)，归一化为hCD34中的水平+脐血细胞。hCD34中DRE与Pr的相互作用较弱−细胞，而在hCD34中观察到8.7倍的富集+细胞。在右侧面板上，Q-RT-PCR数据验证了hCD34型显示了用于3C检测的脐血人群。另请参见补充图S3。
图6
图6
DRE内完整的RUNX站点对人类来说是必要的CD34型SLAM中的表达式+LSK并维持启动子与DRE的相互作用。(A类)结构体A（如图1所示）被修改以包含掀背位于DRE中的站点（构造F）。展开的部分显示了变异的掀背DRE中的位点和框框内的特定突变显示为相对于野生型序列（补充图S5）。(B)来自携带构建体F的小鼠的骨髓细胞的流式细胞术显示了来自六个建立者系之一的一个代表性例子（分析了每个建立者三只小鼠，其中一部分来自两个建立者，我们没有检测到生殖系转基因传递）。基因突变掀背站点大幅减少hCD34型SLAM中的表达式+LSK与SLAM的比较+携带结构体A的小鼠的LSKs百分比（分别从99.2±0.5%（s.d.）到38.1±4.2%（s.d；P（P）=3.44，E−17）和平均荧光强度（分别从8617±125（s.d.）到2342±189（s.d；P（P）=2.1，E−24）。(C类)携带结构体F小鼠的LSK-HSC被细分为hCD34低的和hCD34中间体（hCD34整数)根据本研究中采用的hCD34门控策略进行3C分析。在上面的面板中，分类后分析表明了分类群体的纯度。左下面板显示Q-RT–PCR数据，表明hCD34型hCD34中的表达低的（黑柱；▪) 和hCD34整数种群（白柱；□)，标准化到以下级别hCD34型在携带结构体A的小鼠的LSK-HSC中检测到表达。右下方的面板显示了相同hCD34中启动子和DRE的相对交联频率低的（黑柱；▪) 和hCD34整数（白色柱；□)FACS纯化的细胞，标准化为来自转基因构建体A的小鼠的LSK-HSC的交联频率。DRE与Pr片段的相互作用在hCD34中不太频繁低的单元格(n个=4）比hCD34整数LSKs公司(n个=4），显示较高细胞的相对交联频率增加了5.2倍hCD34型表达式。已从18只转基因小鼠中收集分类群体用于构建F。另请参见补充图S4。
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