Phosphorylation of H4 Ser 47 promotes HIRA-mediated nucleosome assembly

doi:10.1101/gad.2055511

.2011年7月1日；25(13):1359-64.

doi:10.1101/gad.2055511。

H4 Ser 47磷酸化促进HIRA介导的核小体组装

滨康（Bin Kang）¹, 浦敏铁, 胡刚庆, 温伟宏（Weihong Wen）, 紫冈洞, 赵克吉, 布鲁斯斯蒂尔曼, 张志国

附属机构

采购管理信息： 21724829
PMCID公司：项目经理3134079
内政部： 10.1101/gad.2055511

H4 Ser 47磷酸化促进HIRA介导的核小体组装

滨康（Bin Kang）等。基因开发. 2011.

.2011年7月1日；25(13):1359-64.

doi:10.1101/gad.2055511。

作者

滨康（Bin Kang）¹, 浦敏铁, 胡刚庆, 温伟宏（Weihong Wen）, 紫冈洞, 赵克吉, 布鲁斯斯蒂尔曼, 张志国

附属

¹美国明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所医学院生物化学和分子生物学系，邮编55905。

采购管理信息： 21724829
PMCID公司：项目经理3134079
内政部： 10.1101/gad.2055511

摘要

组蛋白H3变体H3.3与标准H3（H3.1）只有五种氨基酸不同，但通过组蛋白伴侣HIRA在基因区域与组蛋白H4组装成核小体，而H3.1在CAF-1依赖反应中组装成核糖体。在这里，我们发现组蛋白H4 Ser 47（H4S47ph）的磷酸化在PAK2激酶的催化下，通过增加HIRA与H3.3-H4的结合亲和力和减少CAF-1与H3.1-H4的关联，促进H3.3-H5的核小体组装，并抑制H3.1-H5的核小体组装。这些结果揭示了H4S47ph明显调节H3.1和H3.3核小体组装的机制。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
PAK2在体内外磷酸化非核小体H4S47。(A类)针对H4S47ph产生的抗体是特异性的。293T细胞和重组H3–H4（rH3–H4）的细胞裂解物（如顶部使用针对H4S47ph肽制备的抗体，通过Western blot分析标记有Flag和HA表位（e-H4）的外源性表达H4的免疫沉淀样品，或相应的S47突变为e（e-H4S47 e）的H4突变体。(B类)与Asf1a和Asf1b相关的H4在S47被PAK2磷酸化。从293T细胞纯化Asf1a和Asf1b，并纯化铜组蛋白(左边)以及不同数量的rH3-H4(*正确的*)使用抗H4S47ph、H3或H4抗体进行Western blot分析。在进行Western blot之前，用Ponceau S（Pon S）对膜进行染色。(C类)PAK2在体外磷酸化非核小体H4的H4S47。从293T细胞中纯化PAK2，然后与ATP和不同组蛋白底物孵育，包括单核小体（MN）、核心组蛋白（CO）和rH3-H4。作为对照，将激酶死亡（KD）的PAK2突变体（K278R）和载体对照（Con）转染到293T细胞中，并使用与PAK2纯化相同的程序进行纯化。使用PAK2、H4S47ph和H4抗体通过Western blot分析反应混合物。(D类,E类)PAK2在体外主要磷酸化H4S47。实验按照中所述进行C类使用重组（H3–H4）₂四聚体和两个突变体（H3–H4）₂H4的S47或T80四聚体转变为丙氨酸（S47A和T80A）和[γ-³²P] -ATP(D类)或ATP(E类). 使用[γ]进行激酶分析-³²P] -ATP，在SDS-PAGE上解析一半的反应混合物。考马斯亮蓝（CBB）染色检测蛋白质，反照法检测磷酸蛋白。(F类)PAK2在体内磷酸化H4S47。HeLa细胞被靶向PAK2（shPAK2）或非靶向对照（NT）的病毒感染。细胞用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）和PAK2或H4S47ph抗体染色，荧光显微镜检测。棒材，10μm。

**图2。**
H4S47ph促进H3.3–H4核小体的形成。(A类)H4S47ph在含H3.3的核小体中富集。使用亲和色谱纯化含e-H3.1-a和e-H3.3的单核小体。在Western blot之前，使用H4S47ph、H4和H3抗体或Pon S染色，通过Western blot检测e-H3.1和e-H3.3的输入以及免疫沉淀单核小体（IP）。(B类)H4S47ph在三个检测到的富含H3.3的基因中富集。使用抗H4S47ph的抗体在两个表达e-H3.1或e-H3.3的细胞系中进行ChIP分析。共沉淀和输入DNA通过实时PCR分析，使用引物退火三个富含H3.3的基因（TTSTM4SF1型和TSSOSTF1号机组或*TP53G1型*)和两个富含H3.1的基因（TSS和TTS阀内件42和*CSRP3型*）。(*C–E类*)在测试的候选基因中，消耗PAK2导致H4S47ph和H3.3的占有率降低，H3.1的占有率增加。用含有PAK2 shRNA或非靶向（NT）载体的病毒感染e-H3.3和e-H3.1细胞系，并使用H4S47ph抗体进行ChIP分析(C类)，e-H3.3(D类)和e-H3.1(E类). 共沉淀DNA通过实时PCR进行分析，如B类. (F类)H4S47E突变体的表达导致候选基因中H3.3的占有率增加。空载体（EV）、e-H4、e-H4S47E或e-H4C47A突变体在e-H3.3细胞系中表达。使用抗e-H3.3抗体进行ChIP分析，并使用实时PCR分析共沉淀DNA。

**图4。**
HIRA和CAF-1的染色质结合受H4S47ph调节。(A类)OA处理的细胞导致H4S47ph升高，HIRA染色质结合增加，CAF-1染色质结合减少。用OA（100 nM）或DMSO（模拟）处理HeLa细胞30分钟。收集S2、S3和P3组分。(左侧面板）使用所示抗体通过Western blot分析TCE和S2、S3和P3组分中的蛋白质。(赖特为了进行比较，加载了三种不同数量的P3组分，并通过Western blot进行了分析。(B类)PAK2的耗尽导致CAF-1的染色质结合增加，HIRA的染色质联系减少。按照中所述进行染色质分馏A类除了使用PAK2缺失或不缺失的细胞。(C类,D类)免疫荧光法检测到OA处理的HeLa细胞中CAF-1和HIRA的染色质结合受到影响。在使用抗p60或HIRA抗体固定免疫荧光之前，用0.5%Triton X-100提取OA或DMSO（模拟）处理的HeLa细胞。用Photoshop测定200个细胞核的平均像素数。使用t吨-测试(*P（P）*< 0.05). (E类,F类)PAK2缺失导致CAF-1染色质结合增加，HIRA染色质结合减少。实验按照中所述进行C类和D类除了使用PAK2缺失和未缺失的细胞。

**图3。**
H4S47ph增加HIRA的相互作用，并抑制CAF-1与其相应的H3–H4分子的相互作用。(A类,B类)用谷氨酸（H4S47E）取代H4S47导致CAF-1结合减少(A类)和Daxx(B类)增加HIRA的结合(A类). 使用亲和色谱纯化e-H4和e-H4S47E蛋白。使用所示抗体通过Western blot检测细胞提取物（Input）和铜纯化蛋白（IP）中的蛋白质。(C类)耗尽PAK2会增加H3–H4与CAF-1的结合，并减少H3–H4与HIRA的结合。利用亲和层析从感染shPAK2（+）或非靶向载体（-）病毒的细胞中纯化CAF-1 e-p60和e-HIRA。使用所示抗体通过Western blot分析全细胞提取物（Input）和铜纯化蛋白（IP）中的蛋白质。(D类)H4S47ph增加HIRA与重组H3.3–H4的结合，并减少CAF-1与H3.1–H4在体外的结合。果蝇（H3.1–H4）₂或（H3.3–H4）₂四聚体从*大肠杆菌*在有（+）或无ATP（-）的情况下与PAK2孵育。然后将CAF-1或HIRA与两种不同数量的反应混合物混合，并使用针对标记的CAF-1 p60和HA标记的HIRA的抗体进行免疫沉淀（IP）。使用所示抗体通过Western blot分析蛋白质。(E类)HIRA的C末端优先与H3.3–H4S47ph结合。使用三个重组HIRA片段（氨基酸，1–420、421–737和738–1017）进行GST下拉实验，这些片段与含有H3.3–H4和PAK2的反应混合物混合，其中含有或不含有ATP，如D类Western blot检测与不同HIRA片段结合的蛋白。

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