跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

点政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息,确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https(https)://确保您连接到官方网站,并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2011年9月;41(9):2753-62.
doi:10.1002/eji.201141391。 Epub 2011年8月4日。

HMGB1内脂多糖结合肽区的鉴定及其对小鼠亚临床内毒素血症的影响

附属公司
免费PMC文章

HMGB1内脂多糖结合肽区的鉴定及其对小鼠亚临床内毒素血症的影响

Ju Ho Youn先生等。 欧洲免疫学杂志. 2011年9月.
免费PMC文章

摘要

当脂多糖(LPS)释放到循环中时,会触发有害的全身炎症反应。血清中的LPS结合蛋白(LBP)通过促进其与LPS应答细胞表面表达的LPS信号受体的相互作用,在改善LPS毒性方面发挥着重要作用。我们之前已经证明,高迁移率族框1(HMGB1)可以与LPS结合并转移LPS,从而增加LPS诱导的人外周血单个核细胞(PBMC)中TNF-α的产生。我们在此报告HMGB1中两个LPS结合域的鉴定。此外,使用12个合成HMGB1肽,我们定义了每个结构域内的LPS结合区域。其中,位于HMGB1的A盒结构域和B盒结构域的合成肽HPep1和HPep6分别与LPS的多糖和脂质A部分结合。HPep1和HPep6肽均抑制LPS与LBP和HMGB1的结合,LBP介导的LPS向CD14的转移,以及RAW264.7细胞对LPS的细胞摄取。在亚临床内毒素血症小鼠模型中,这些肽还抑制LPS诱导的人PBMC中TNF-α的释放,并诱导血清中TNF-α水平降低。这些结果表明HMGB1具有两个LPS结合肽区,可用于设计抗消化或LPS中和治疗药物。

PubMed免责声明

数字

图1
图1
HMGB1结构域的LPS结合特异性。(A) 生物素标记大肠杆菌LPS与6×His标记HMGB1 A和B盒蛋白孵育,并进行下拉分析。对珠子进行12%的SDS-PAGE,并使用抗-His抗体(B,C)进行Western blot分析。将等分的5μg/mL生物素–LPS与5μg/mL His标记的A盒或B盒HMGB1蛋白孵育,该蛋白已与不同量的大肠杆菌脱脂LPS,明尼苏达州南部脂质A,明尼苏达州Re595 LPS或WT明尼苏达州南部LPS作为抑制剂。生物素–LPS沉淀后,用Western blotting和抗-His Ab进行分析。(C)该线表示相同印迹膜的切痕。所示数据代表了两个独立的实验。
图2
图2
HMGB1 LPS结合区的定位。(A) 制备了12种合成的生物素标记HMGB1肽,用于LPS结合研究。方框A和B以及酸性尾域下划线。(B) 简言之,将每种生物素标记的HMGB1肽10μg/mL与10μg/mL LPS孵育。用链霉亲和素琼脂糖珠进行下拉试验,并用Western blotting进行分析。用抗LPS抗体探测膜。WT HMGB1作为阳性对照(左)。使用四种选定的肽(右)重复该分析。(C) 用10μg/mL的PBS中的LPS涂布微量滴定板,并用0.05%吐温-20 PBS洗涤。向微孔中添加不同浓度的生物素标记HMGB1肽,然后添加HRP-结合链霉亲和素。TMB溶液用作底物进行显色。所示数据代表了两个独立的实验。
图3
图3
HMGB1肽与LPS的结合。(A) HMGB1肽与LPS相互作用的竞争结合分析。用LPS包被微滴度板,并在不同量的存在下将相同量的肽1(HPep1)或肽6(HPep6)加入孔中明尼苏达州南部Re595 LPS,明尼苏达链球菌脂质A,或大肠杆菌脱脂LPS。重量明尼苏达链球菌LPS作为阳性对照抑制剂。用HRP偶联链霉亲和素检测HMGB1肽与LPS的结合。(B,C)HMGB1肽抑制LPS与LBP和HMGB1的结合。(B) 简单地说,在存在不同数量HMGB1肽的情况下,向LPS涂层孔中添加100 ng/mL LBP。使用抗LBP抗体检测LBP与LPS的结合。多粘菌素B用作阳性对照抑制剂。(C) 生物素标记的LPS与5μg/mL HMGB1在HPep1和HPep6肽混合物中孵育,并使用链霉亲和素琼脂糖珠进行下拉分析。使用抗HMGB1抗体进行Western blot分析。显示的数据是两个独立实验的代表性数据。
图4
图4
HMGB1 A和B盒结构域肽将BODIPY FL-LPS转移到CD14的能力。(A) 将BODIPY FL-LPS和sCD14的混合物在HMGB1 A盒、B盒和GST酸性尾蛋白存在下孵育,并在25°C下10 h后测量荧光水平。LBP作为阳性对照,使用2%十二烷基硫酸钠完全溶解LPS的分解状态,以获得最大荧光。(B) HMGB1与CD14的相互作用。将2或10μg GST-HMGB1蛋白与RAW264.7细胞(顶部)的全细胞裂解液或重组CD14蛋白(中部)孵育,然后用谷胱甘肽-脑葡萄糖4B珠沉淀。使用抗CD14抗体进行Western blot分析。以全细胞裂解物作为阳性对照。通过ELISA(底部)测定HMGB1 A和B盒肽与重组CD14蛋白的结合。将6-His标记的A盒和B盒蛋白滴定到CD14包被孔中,并使用抗-His抗体作为主要抗体。(C)HMGB1肽介导LPS转移到sCD14。总之,在每种HMGB1肽2.5μg/mL的存在下培养1μg/mL BODIPY FL-LPS和5μg/mL CD14蛋白。在25°C下10小时后,在525 nm处用488 nm激发测量荧光水平。LBP和HMGB1蛋白作为阳性对照。热处理HMGB1作为对照。所示数据代表三个独立实验。误差线:标准偏差。
图5
图5
HPep1和HPep6抑制LPS转移。(A) 将BODIPY FL-LPS、CD14蛋白和LBP的混合物在不同量的HPep1和HPep6存在下培养,并测量荧光水平的变化。(B) RAW264.7细胞与BODIPY FL-LPS和LBP的混合物在每个HMGB1肽的存在下孵育,并在洗涤后测量RAW2647细胞的荧光水平。(C) RAW264.7细胞与预先孵育的100μg/mL FITC-结合LPS和100μg/mL HMGB1肽HPep1或HPep6的混合物在10%FBS-DMEM中孵育。洗涤后用流式细胞仪分析FITC-LPS的结合。所显示的数据代表了两个或三个独立的实验。
图6
图6
HMGB1肽抑制人PBMC中TNF-α的生成。人PBMC(5×106在无血清Opti-MEM®培养基中,在HMGB1肽各2.5μg/mL存在下,用1 ng/mL LPS和200 ng/mL LBP的预孵混合物刺激细胞/mL)。将培养物在37°C下孵育16小时,并使用夹心ELISA测定培养上清液中TNF-α的浓度。所示数据为三个独立实验的平均值和标准偏差。
图7
图7
HMGB1肽HPep1和HPep6在亚临床内毒素血症小鼠模型中的中和作用。静脉注射亚临床剂量100 ng超纯BALB/c小鼠大肠杆菌LPS和100μg HPep1或HPep6。使用不与LPS结合的HPep3(HMGB1肽3号)作为阴性对照。每组评估6只小鼠。注射后2h采集血清样本,采用夹心ELISA法测定血清TNF-α浓度。表示标准偏差的误差条。所示数据代表了两个独立的实验。邓恩检验(非参数)用于计算第页-值。

类似文章

引用人

工具书类

    1. Raetz CR,Whitfield C.脂多糖内毒素。每年。生物化学版。2002;71:635–700.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Park BS、Song DH、Kim HM、Choi BS、Lee H、Lee JO。TLR4-MD-2复合物识别脂多糖的结构基础。自然。2009;458:1191–1195.-公共医学
    1. Lotze MT,Tracey KJ。高迁移率族蛋白1(HMGB1):免疫武库中的核武器。《自然免疫学评论》。2005;5:331–342.-公共医学
    1. Bonaldi T、Talamo F、Scaffidi P、Ferrera D、Porto A、Bachi A、Rubartelli A等。单核细胞超乙酰化染色质蛋白HMGB1,使其重新定向分泌。EMBO J.2003;22:5551–5560.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Youn JH、Shin JS。HMGB1的核质穿梭受到磷酸化的调节,磷酸化将HMGB1导向分泌。免疫学杂志。2006;177:7889–7897.-公共医学

出版物类型

MeSH术语