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.2011年5月11日；19（5）:675-90。
doi:10.1016/j.str.2011.02.016。

短暂结合激活：第二催化镁的瞬时结合激活CDK2激酶的结构和动力学以进行催化

赵秦宝 1, 道格拉斯·雅各布森, 马修·A·杨
附属公司

短暂结合激活：第二催化镁的瞬时结合激活CDK2激酶的结构和动力学以进行催化

赵秦宝等。 结构. .

摘要

我们测定了与ADP、底物肽和MgF（3）（-）结合的CDK2/Cyclin a过渡态复合物的高分辨率晶体结构。与活性CDK2的先前结构相比，激酶的催化亚单位在活性位点周围采用了更封闭的构象，现在允许在活性位点中观察到第二个Mg（2+）离子。再加上[Mg（2+）]对体外激酶活性的强烈影响，这些结构表明，为了实现化学反应的最大速率增强，第二个Mg（2+）离子的瞬时结合是必要的，Mg（3+）浓度可能是体内CDK2活性的重要调节器。分子动力学模拟说明了底物肽、ATP和两个Mg（2+）离子的同时结合是如何诱导活性位点形成更为刚性和封闭的组织的，该活性位点的功能是定向磷酸盐、稳定负电荷的积累，以及保护随后活化的γ-磷酸盐不受溶剂的影响。

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数字

图1
图1。pCDK2/CyclinA-ADP/MgF的结构三−/肽复合物及其活性位点的细节
A） 综合体概述。催化亚基为灰色，CyclinA为黄色。B） 蛋白质活性部位特写（面板a中突出显示的区域），显示ADP、Mg离子、MgF三-和肽底物（绿色）。底物肽（PKTPKK）第二拷贝的C末端区域阿克勒)确定已绑定到CyclinA上的“RXL”基板绑定槽，也显示为绿色。以灰色显示的该肽的N末端区域基本上是无序的，并以0占据率建模。C） 平均踢出的fo-fc差分图（5σ）省略图，其中MgF三−模型中省略了。D–F）活性位处2fo-fc电子密度的三个视图（蓝色=1.25σ洋红=3.5σ）。红色球体是水，绿色球体是镁2+参见补充图1。
图1
图1。pCDK2/CyclinA-ADP/MgF的结构三−/肽复合物及其活性位点的细节
A） 综合体概述。催化亚基为灰色，CyclinA为黄色。B） 蛋白质活性部位特写（面板a中突出显示的区域），显示ADP、Mg离子、MgF三-和肽底物（绿色）。底物肽（PKTPKK）第二拷贝的C末端区域阿克勒)确定已绑定到CyclinA上的“RXL”基板绑定槽，也显示为绿色。以灰色显示的该肽的N末端区域基本上是无序的，并以0占据率建模。C） 平均踢出的fo-fc差分图（5σ）省略图，其中MgF三−模型中省略了。D–F）活性位处2fo-fc电子密度的三个视图（蓝色=1.25σ洋红=3.5σ）。红色球体是水，绿色球体是镁2+参见补充图1。
图2
图2。肽底物和第二Mg结合诱导的N-叶运动2+离子
A） 品红是1JST.pdb：与ATP和1 Mn结合的pCDK2/CyclinA复合物2+离子。蓝色：与ADP/MgF结合的pCDK2/CyclinA的过渡态结构三−/2*镁2+/肽底物。结构排列在α-碳（Cα)使用PyMOL（DeLano，2010）绘制黑线表示等效Cα原子位置。
图3
图3。与ATP类似物结合的CDK2/CyclinA活性位点区域与过渡态复合物的比较
A） CDK2/Cyclin复合物的三个独立晶体结构的叠加，显示核苷酸和富含甘氨酸环的不同构象（pdb条目：1fin、1jst、2hcc）。激酶激活环（145–168）中的残留物呈洋红色。B） 1QMZ.pdb，pCDK2/CyclinA与AMPPNP/1Mg离子/底物肽（蓝色）结合的叠加，具有过渡态结构（灰色）。
图4
图4。CDK2-TS复合物与PKA的比较
A、 B）CDK2和PKA过渡态模拟复合物的叠加（1l3r.pdb）。CDK2为蓝色，CyclinA为灰色，PKA为橙色。
图5
图5。反应物和镁的配位2+CDK2活性位点中的激活物。在以前的CDK2核苷酸结构中未发现MgI
A） 概述显示了50%VdW接触半径下的MgI和MgII（绿色）。B） 特写强调磷酸盐和底物Thr相互作用：α-磷酸盐：Lys33，MgII；β-磷酸盐：Gly16-NH，MgI，MgII；γ-磷酸盐（MgF三-)：MgI、MgII、Thr14-NH；底物Thr:Asp127，Lys129。富含甘氨酸环的酰胺与β和γ-磷酸盐接触。Asp127和Lys129参与与活性底物Thr的氢键。C） ATP-磷酸盐相互作用示意图。D） 两个镁离子的配位环境。E） 天冬氨酸145在DFG基序F）MgI中的配位是由天冬氨酰145（DFG）氧、两种水、β-磷酸盐和γ-磷酸盐模拟物协调的。G） MgII由Asn132、α和β磷酸盐、水和γ磷酸盐模拟物协调。
图5
图5。反应物和镁的配位2+CDK2活性位点中的激活物。在以前的CDK2核苷酸结构中未发现MgI
A） 概述显示了50%VdW接触半径下的MgI和MgII（绿色）。B） 特写强调磷酸盐和底物Thr相互作用：α-磷酸盐：Lys33，MgII；β-磷酸盐：Gly16-NH，MgI，MgII；γ-磷酸盐（MgF三-)：MgI、MgII、Thr14-NH；底物Thr:Asp127，Lys129。富含甘氨酸环的酰胺与β和γ-磷酸盐接触。Asp127和Lys129参与与活性底物Thr的氢键。C） ATP-磷酸盐相互作用示意图。D） 两个镁离子的配位环境。E） 天冬氨酸145在DFG基序F）MgI中的配位是由天冬氨酰145（DFG）氧、两种水、β-磷酸盐和γ-磷酸盐模拟物协调的。G） MgII由Asn132、α和β磷酸盐、水和γ磷酸盐模拟物协调。
图6
图6。镁2+反应的依赖性
pCDK2/CyclinA复合物的活性与镁的关系2+浓度。虚线表示1mM[Mg2+]其中，800μM ATP预计会被1个结合镁饱和2+.A）使用γ-P进行分析32标记的ATP和肽底物。B） 利用组蛋白H1底物进行偶联激酶分析。两种分析均采用饱和底物浓度进行。
图7
图7。pCDK2/CyclinA复合体的四种MD模拟的结构和分析
模拟预测，活性位点（MgI位置）中第二个Mg离子的结合稳定了富含Gly环的向下构象，排出了核苷酸磷酸盐周围的水，并降低了磷酸盐的构象灵活性。A–C）从1QMZ.pdb（pCDK2/CyclinA/AMPPNP/1Mg/肽）开始，模拟pCDK2/CyclinA与ATP和2Mg离子结合的三张快照（橙色）。过渡态的晶体结构以灰色叠加。模拟开始时，在MgI现场放置了第二个Mg。富Gly环在~18ns后转化为闭合构象。D） 在富Gly环采用闭合构象后，从轨迹的最后30ns开始的1ns间隔快照的叠加。E） 50ns模拟的1ns间隔快照也从1QMZ.pdb开始，但只有1 Mg结合在活性部位（MgII位置）。顶部和中部时间序列图通过测量ATP或ADPβ磷酸盐到富含Gly环中最近的酰胺基团的距离，量化了富含Gly的环与ATP磷酸盐的接近程度。面板a–c和e中所示结构的起源用圆圈表示。顶部）过渡状态模拟（灰色）和2Mg*ATP pCDK2/CyclinA复合体的模拟。中）pCDK2/CyclinA与1Mg和ATP结合的两个模拟。在三种晶体结构中测量的相应距离用水平线表示。底图）测量所示轨迹中距离ATP/ADP b-磷酸盐小于4°的水的数量（1ns窗口平均值，1个标准偏差）。F、 G）2Mg（F）和1Mg（G）轨迹的快照，显示距离ATP磷酸盐小于4°的水域。另请参见补充图2。
图8
图8。3种MD轨迹中蛋白质骨架波动的程度
显示的各向异性热椭球包含Cα原子50%的原子位置概率，相对于每个模拟的20–50ns时间段内的平均原子位置进行计算。模拟与图7相同：A）pCDK2/CyclinA与ATP和1Mg，B）pCDK1/CyclinA和ATP和2Mg，C）pCDK2/CyclonA/ADP/2MgF三−/底物肽。D） 顶部图表通过绘制对数来指示每个残留物的波动程度1050%概率的Cα椭球体体积。底部图显示了波动之间的差异（对数10椭球体积）以及1Mg（绿色）和2Mg（黄色）模拟。阴影区域表示核苷酸5.0°范围内的残基。G表示富含甘氨酸的环，D是DFG区域；A、 R、P表示ATP中的腺苷、核糖和磷酸原子。
图9
图9。柔性甘氨酸
A、 B:TS结构中CDK2活性部位的静电势的两种观点。刻度范围为−30kT（红色）到0（白色）到+30kT（蓝色）。计算中只包括蛋白质原子，但ADP（棒）、Mg离子（绿色球体）和MgF三−（斗杆）以供参考。（b）中的视图相对于（a）大致垂直旋转，使得该视图是从衬底Thr的角度沿着Thr-MgF三−-ADP反应载体。C.D：富含甘氨酸环的闭合会排出溶剂并封闭磷酸盐。两片通过溶剂可接触的表面呈现活性部位。
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