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.2011年6月15日；22(12):2083-93.
doi:10.1091/mbc。E10-11-0873。 Epub 2011年4月27日。

C4orf41和TTC-15是哺乳动物TRAPP成分，在ER-Glgi贩运的早期阶段发挥作用

P詹姆斯·斯克里文斯 1, 巴拉亚·努埃希德, 纳西姆·沙赫扎德, Sokunthear Hul公司, 斯蒂芬妮·布鲁特, 迈克尔·萨切尔
附属公司

C4orf41和TTC-15是哺乳动物TRAPP成分，在ER-Glgi贩运的早期阶段发挥作用

P詹姆斯·斯克里文斯等。 摩尔生物细胞. .

摘要

TRAPP是一种多亚单位系链复合体，与酿酒酵母的多个囊泡运输步骤有关，在真核生物（包括人类）中广泛存在。在此，我们确认TRAPPC2L作为哺乳动物TRAPP的稳定成分的作用，并报告了该复合物的四个新成分的鉴定：C4orf41、TTC-15、KIAA1012和Bet3L。其中两种成分，KIAA1012和Bet3L，分别是Trs85p和Bet3p的哺乳动物同源物。其余两个新的TRAPP成分C4orf41和TTC-15在酿酒酵母中没有同源物。通过这项工作，除酵母菌特异性亚单位Trs65p外，所有酿酒酵母TRAPP蛋白的人类同源物现已被报道。通过多学科方法，我们证明这些新蛋白是人类TRAPP的真正组成部分，并在早期阶段将C4orf41和TTC-15（我们分别称为TRAPPC11和TRAPPC12）牵涉到ER-Glgi贩运中。我们进一步提出了所有已知哺乳动物TRAPP组分的二元相互作用图，并证明TRAPP齐聚物。我们的数据与哺乳动物细胞中缺少TRAPP I等效复合物的情况一致，表明哺乳动物TRAPP的基本单位与酿酒酵母的基本单位不同。

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图1：
图1：
哺乳动物TRAPP新成分的鉴定。（A） 用空载体转染HEK293T细胞，或用TAP-C2或TAP-C2L转染。将裂解产物进行两步亲和纯化并用SDS-PAGE进行分离。切除带并进行质谱鉴定。在某些情况下，谱带无法分辨，并通过质谱法分析整个洗脱液。诱饵带指C2（第2车道）或C2L（第3车道）。TTC15/TRAPPC12标有星号，因为它没有在凝胶切片中识别出来，而是在对非凝胶溶解蛋白制剂进行质谱分析之后识别出来的。请注意，凝胶的不均匀染色是由于在凝胶的溶解部分使用了不连续的梯度。（B） 转染FLAG-C2L和myc-C2（第1道）的HEK293T细胞的裂解液用免疫前兔血清（第2道）或抗FLAG-IgG（第3道）处理，沉淀物用抗myc-IgG进行Western分析。（C） TAP纯化后的洗脱液是从转染了空质粒（载体）或TAP-C4orf41的细胞中分离出来的。将凝胶转移到PVDF膜上，并探测指示TRAPP蛋白的存在。（D） 用HA-C4orf41转染HEK293T细胞。裂解物与免疫前血清（第2道）、抗HA（第3道）或抗TTC15/C12（第4道）孵育。然后通过SDS-PAGE对免疫沉淀物进行分级，并检测是否存在C2、C2L、C3、C12或HA（表明存在C4orf41/C11）。代表沉淀样品10%的输入显示在通道1中。
图2：
图2：
TRAPP组分的尺寸排除色谱法。（A） 未转染或转染V5-C8或V5-C10的HEK293T细胞的裂解液在Superdex 200大小的排除柱上进行分离。收集组分（0.5 ml），并使用内源性C2、C2L、C3、C11和C12抗体或抗V5抗体对每秒钟的组分进行Western分析，以检测转染的C8或C10。（B） HeLa细胞用非特异性siRNA（KD:NS）或抗C11（KD:C11）siRNA处理。如上所述，通过尺寸排阻色谱对裂解物进行分级，并使用抗-C2抗体（顶部两个面板）或抗-C12抗体（底部两个面板）进行Western分析。（C） 用非特异性siRNA（NS）或抗C11或C12的siRNA处理转染HA-C11的HeLa细胞。通过Western blotting分析等量的裂解产物，并探测是否存在微管蛋白（负荷控制）、C2、C2L、C3、C11（使用抗HA）和C12。
图3：
图3：
TRAPPC8、TRAPPC11或TRAPPC12的耗尽导致高尔基体扩散。如图所示，用非特异性siRNA或抗C8、C11或C12的siRNA处理HeLa细胞。如图所示，用ERGIC53、GM130和甘露糖苷酶II抗体对细胞进行染色。条形代表10μm。使用GM130作为标记物对表型进行定量分析表明，来自C8、C11和C12敲除的细胞分别有73%（n=125）、88%（n=43）和88%（n=42）显示高尔基体碎片，而来自非特异性siRNA对照的细胞分别为6%（n=97）、2%（n=52）和2%（n=22）。
图4：
图4：
TRAPPC12的本地化。（A） 用非特异性（NS；顶行）或C12-特异性（中行）siRNA处理HeLa细胞，并对其进行C12和ERGIC53染色，然后通过外荧光显微镜观察（上两行）。NS-处理细胞（第三排）共聚焦图像的最大投影重现了外荧光显微镜下看到的点状核周C12定位。（B） 未经处理的HeLa细胞的单个共聚焦切片共染C12和Sec23a、ERGIC53、GM130或Man II。（C） 用10μM诺卡唑处理HeLa细胞1小时，然后用C12抗体和ERGIC53、GM130或Man II染色，如图所示。（D） 在用荧光标记的EGF或转铁蛋白（Tfn）孵育之前，将HeLa细胞血清饥饿2小时。（A）和（B）中的比例尺代表10μm，而（C）和（D）中的标尺代表2μm。
图5：
图5：
TRAPPC11或TRAPPC12的耗尽会干扰ts045-VSV-G-GFP的贩运。用非特异性siRNA（A）或针对C11（B和D）或C12（C和E）的siRNA处理HeLa细胞。48小时后，用编码ts045-VSV-G-GFP的质粒转染细胞。然后将细胞移到39.5°C下培养6小时（A，左），然后在32°C下孵育30分钟（所有其他面板）。然后用抗Sec31或抗ERGIC53对细胞进行染色，如图所示。（B–E）中的右侧面板表示两个面板直接向左的合并图像。（A）中的标尺为10μm，其他所有标尺为2μm。
图6：
图6：
ts045-VSV-G-GFP在TRAPPC11耗尽后被滞留在BFA抗性隔间中。（A） HeLa细胞按图5所示进行处理，但细胞在32°C下3.5小时后进行荧光显微镜处理。检查的标记显示在每个面板中。（B） C11缺失HeLa细胞中观察到的贩运缺陷的量化。从39.5°C释放后，从3个独立重复中计算每个重复约30个细胞。（C） 按照（A）中的方法处理HeLa细胞，除了在32°C孵育30分钟后，将BFA添加到培养物中。比例尺代表10μm。
图7：
图7：
哺乳动物TRAPP形成低聚物。（A） HEK293T细胞与FLAG-C2L/myc-C2L、V5-C10/GFP-C10、V5-%11/HA-C11或V5-C12/GFP-C12共转染。用免疫前兔血清（泳道1）、抗-FLAG（用于C2L转染）或抗-V5（用于C10、C11和C12转染）IgG处理裂解物，然后用抗-myc（用于C2L转染）、抗-GFP（用于C10和C12转染）或抗-HA（用于C11转染）IgG探测。（B） 通过凝胶过滤色谱分离（A）中的裂解产物。将含有高分子量TRAPP的组分合并，进行免疫沉淀，并按（A）所示进行探测。（C） 利用酵母双杂交和共免疫沉淀数据建立哺乳动物TRAPP结构模型。蓝色阴影的子单元是根据先前发布的子综合体（Kim等。, 2006). 高分子量亚基（C8–C12）由一个淡紫色椭圆表示。鉴于高分子量组分与TRAPP“核心”两端的蛋白质之间的相互作用，即它们之间的高分子量亚基相互作用网络，以及如（a）和（B。这两个模型在第二个“核心”的方向上有所不同。有关详细信息，请参阅正文。
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