跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2011年3月；31(6):1174-85.
doi:10.1128/MCB.00903-10。 Epub 2011年1月18日。

通过p130Cas酪氨酸磷酸化的Neuropilin-1信号传导对胶质瘤和内皮细胞的生长因子依赖性迁移至关重要

伊恩·M·埃文斯 1, 山治美子, 加里·布里顿, 卡罗琳·佩莱特·马尼, 克莱尔·洛基, 伊恩·扎卡里, 保罗·弗兰克尔
附属公司

通过p130Cas酪氨酸磷酸化的Neuropilin-1信号传导对胶质瘤和内皮细胞的生长因子依赖性迁移至关重要

伊恩·M·埃文斯等。 分子细胞生物学. 2011年3月.

摘要

神经毛蛋白-1（NRP1）是血管内皮生长因子（VEGF）的受体，在调节细胞运动中起重要作用。然而，对细胞运动重要的NRP1信号通路却知之甚少。在此，我们报告了p130（Cas）酪氨酸磷酸化在U87MG胶质瘤细胞中由肝细胞生长因子和血小板衍生生长因子刺激，在内皮细胞中由VEGF刺激，并通过其胞内结构域依赖于NRP1。在内皮细胞中，NRP1沉默降低但没有阻止VEGF受体2（VEGFR2）磷酸化，而缺乏细胞内结构域（NRP1ΔC）的NRP1突变形式的表达并不影响U87MG细胞或人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中的受体磷酸化。在HUVEC中，NRP1也需要用于VEGF诱导的富含脯氨酸的酪氨酸激酶2的磷酸化，这是p130（Cas）磷酸化所必需的。重要的是，NRP1或p130（Cas）的敲低或NRP1ΔC或非酪氨酸磷酸化底物域突变蛋白（p130（Cas15F））的表达足以抑制生长因子介导的胶质瘤和内皮细胞的迁移。这些数据首次证明了NRP1胞内结构域在介导几种受体酪氨酸激酶下游的特定信号通路中的重要性，并确定了新的NRP1-p130（Cas）通路在趋化性调节中的关键作用。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
生长因子刺激的p130酪氨酸磷酸化卡斯通过神经胶质瘤和内皮细胞中的NRP1介导。（A） 用靶向NRP1（siNRP1）或25 nM对照加扰siRNA（siScr）的25 nM siRNA转染U87MG细胞。在转染后48小时，细胞在无血清培养基（SFM）中培养约18小时，然后用SFM载体对照物（C）处理，或用25 ng/ml HGF（h）或50 ng/ml PDGF-BB（P）处理5分钟。然后制备细胞裂解物，进行印迹，并用指示的抗体进行探测。显示了U87MG细胞中硫酸软骨素-糖基化NRP1（NRP1-CS；250 kDa）和未修饰NRP1的位置。（B） 用200 nM siNRP1或200 nM siScr转染HUVEC。转染后48小时，将细胞转换为含有0.5%（vol/vol）血清的EBM，并孵育过夜。然后用SFM载体对照（C）或25 ng/ml VEGF-A（V）处理细胞10分钟。然后制备细胞裂解物，进行印迹，并用指示的抗体进行探测。（C） 用SFM加100μM EG0086（肽拮抗剂）、5μg/ml NRP1阻断抗体（Ab）或载体（对照）预孵育汇合的HUVEC 30分钟，然后用25 ng/ml VEGF-A（V）或无进一步处理（C）刺激10分钟。然后制备细胞裂解物，进行印迹，并用指示的抗体进行探测。（D和E）U87MG细胞和HUVEC按照面板A和B的描述进行处理，并用指示的抗体进行探测。此处和所有后续图中显示的斑点代表了至少三个单独的实验。在面板A、B和C中，p130的定量卡斯使用ImageJ通过密度测定进行磷酸化。在每个面板中，来自三个独立实验的数据以p130的相对单位（RU）表示卡斯磷酸化（平均值±SEM）归一化为总p130卡斯. *,P（P）< 0.05; **,P（P）<0.01（与配体刺激的siScr或对照相比）；#，P（P）<0.05（与对照组相比[C]）。
图2。
图2。
NRP1胞内结构域是p130的生长因子刺激酪氨酸磷酸化所必需的卡斯（A）U87MG细胞（～80%融合）在MOI为10时感染Ad.GFP、Ad.NRP1或Ad-NRP1ΔC。感染后48小时，在使用HGF和PDGF治疗之前，将细胞在SFM中培养约18小时，如图1图例所示。（B） 按照A组的详细说明感染汇合的HUVEC，在感染48小时后，将细胞切换到含有0.5%（vol/vol）血清的EBM，并培养过夜。用SFM载体对照（C）或25 ng/ml VEGF-A（V）治疗HUVEC。然后制备细胞裂解物，进行印迹，并用指示的抗体和p130进行探测卡斯磷酸化被量化，P（P）<0.05（与Ad.GFP加VEGF、HGF或PDGF相比）；#，P（P）<0.05（与对照组相比[C]）。
图3。
图3。
RTK磷酸化不需要NRP1的细胞溶质域。（A） HUVEC被转染，并按照图1B图例所述进行处理。然后制备细胞裂解物，并通过ELISA测定总VEGFR2和磷酸化VEGFR2（pY1175）水平。（B） 如图1A图例所示，转染U87MG细胞并用PDGF-BB处理。制备细胞裂解物，并通过ELISA测定PDGFRβ和磷酸化PDGFRα（总酪氨酸）水平。对于面板A和B，来自三个独立实验的数据以相对磷酸化单位（RU）（平均值±SEM）表示，并归一化为总受体水平。*，P（P）<0.05（与VEGF处理的siScr相比）。（C） 如图1A图例所示，转染U87MG细胞并用HGF处理。然后制备细胞裂解物，进行印迹，并用抗体探测总c-Met和磷酸化c-Met（Tyr1234/1235）。（D、E和F）制备图2A和B中的细胞裂解物，并用所示抗体进行印迹和探测。磷酸化的量化如图1图例所示。在每一组的任何病毒治疗之间，生长因子刺激的受体磷酸化没有显著差异。
图4。
图4。
PYK2对p130刺激的要求卡斯酪氨酸磷酸化。（A） 用25 nM siRNA靶向FAK（siFAK）或25 nM siScr转染U87MG细胞，并按照图1A图例所述处理细胞。（B） 用200 nM siFAK或200 nM siScr转染HUVEC，并按照图1B图例所述处理细胞。（C） 用靶向PYK2（siPYK1）或25 nM siScr的25 nM siRNA转染U87MG细胞，并按照图1A图例所述处理细胞。（D） 用200 nM siPYK2或200 nM siScr转染HUVEC，并如图1B图例所述处理细胞。然后制备细胞裂解物，进行印迹，并用指示的抗体进行探测。面板C和D中，p130卡斯磷酸化被量化，如图1图例所示。*，P（P）<0.01（与siScr相比）；#，P（P）<0.05（与对照组相比[C]）。每个膜中的所有样品均在同一凝胶中进行，并在同一膜上进行印迹；面板D虚线两侧的样本不相邻，而是由使用计算机软件删除的车道分隔。
图5：。
图5：。
VEGF介导的PYK2酪氨酸磷酸化依赖于NRP1表达和结合VEGF的能力。（A） 用200 nM siNRP1或200 nM siScr转染HUVEC，然后按照图1B图例所述进行处理。（B） 将汇合的HUVEC与100μM EG00086（肽拮抗剂）、5μg/ml NRP1阻断抗体（Ab）或载体（水，对照）预孵育30分钟，然后刺激±25 ng/ml VEGF 10分钟。然后制备细胞裂解物，进行印迹，并用指示的抗体进行探测。如图1图例所述，对PYK2磷酸化进行量化，并将其归一化为总PYK2*水平，P（P）<0.05（与siScr和对照组相比）。
图6。
图6。
FAK抑制不影响p130的生长因子刺激卡斯磷酸化。（A） 将汇合的HUVEC与0.5或5μM PF573228或载体（0.05%[vol/vol]二甲基亚砜）（veh）预培养30分钟。然后按照图1B图例中的说明处理细胞。（B） 在50 nM或5μM的条件下，用载体或PF573228预处理U87MG细胞30 min。然后按照图1A图例中的说明处理细胞。然后制备细胞裂解物，进行印迹，并用指示的抗体探测。所示的斑点是至少三个独立实验的代表。
图7。
图7。
生长因子介导的NRP1和酪氨酸磷酸化p130共定位的增加卡斯（A）将HUVEC接种到玻璃盖玻片上，并在使用SFM载体控制或25 ng/ml VEGF治疗之前，在EBM中的0.5%FCS中培养约18小时。（B） 将U87MG细胞接种在玻璃盖玻片上，并在SFM中孵育约18小时，然后用SFM载体对照物或25 ng/ml HGF或50 ng/ml PDGF-BB治疗5分钟。按照材料和方法中的描述进行共聚焦成像，NRP1染色为绿色，磷酸化p130卡斯（Y410）染色为红色。合并图像显示NRP1和磷酸化p130共染色卡斯Y410为黄色，代表至少三个单独的实验。NRP1和磷酸化p130的定量卡斯图中显示了共定位（如材料和方法中所述），并表示了三个独立实验的数据，表示为体素数的共定位（平均值±SEM）。*，P（P）<0.05（与SFM控制相比）。
图8。
图8。
NRP1和p130的要求卡斯用于HGF、PDGF和VEGF刺激U87MG细胞和HUVEC的趋化迁移。（A） 用25 nM siNRP1和25 nM sip130转染U87MG细胞卡斯或25 nM siScr持续48 h。然后按照材料和方法中所述，在Transwell迁移分析中测定25 ng/ml HGF或50 ng/ml PDGF-BB引起的细胞迁移。（B） 用200 nM siNRP1和200 nM sip130转染HUVEC卡斯或200 nM siScr持续48小时，并根据面板A中的描述测定25 ng/ml VEGF-A引起的细胞迁移。值(n个≥3）是平均值±SEM，表示为每个场迁移的细胞数量；*，P（P）< 0.05; **,P（P）<0.01（与siScr相比）。插图显示了siRNA介导的NRP1和p130基因敲除的代表性斑点卡斯.
图9。
图9。
第130页卡斯调节U87MG细胞的可塑性。（A） 用25 nM sip130转染U87MG细胞卡斯，25 nM sip130卡斯#2或25nM的siScr培养48小时。将细胞在SFM中孵育18小时，并使用Zeiss Axiovert 200倒置显微镜获得图片。插图显示p130的水平卡斯击倒。（B） 用200 nM sip130转染HUVEC卡斯或200 nM siScr培养48 h。将细胞在0.5%（vol/vol）血清中培养18 h，并按照面板A所述获得图片。（C）U87MG细胞感染Ad.LacZ，Ad.p130卡斯，或Ad.p130案例15F感染后48小时，细胞在SFM中孵育约18小时，如前所示。
图10。
图10。
第130页卡斯U87MG细胞和HUVEC的趋化迁移需要酪氨酸磷酸化。（A和B）U87MG细胞和HUVEC感染Ad.LacZ、Ad.p130卡斯和Ad.p130案例15F48小时后用HGF、PDGF和VEGF治疗，如图2图例所示。三个独立实验的数据以p130的相对单位（RU）表示卡斯磷酸化（平均值±SEM）归一化为GAPDH.*，P（P）<0.01（与Ad.p130相比卡斯加上增长因子）；#，P（P）<0.01（与对照组相比[C]）。（C和D）按照面板A和B的描述感染细胞，48小时后，按照图8的图例所述，分析U87MG细胞中HGF和PDGF以及HUVEC中VEGF刺激的迁移。值(n个≥3）是平均值±SEM，表示为每个场迁移的细胞数量。*，P（P）<0.01（与Ad.p130相比卡斯加上增长因子）；#，P（P）<0.01（与对照组相比[C]）。
图11：。
图11：。
NRP1胞内结构域对HGF、PDGF和VEGF刺激U87MG细胞和HUVEC趋化迁移的需求。（A） 用Ad.GFP、Ad.NRP1或Ad.NRPlΔC感染U87MG细胞48小时。然后测定25 ng/ml HGF或50 ng/ml PDGF引起的细胞迁移。（B） 将汇合的HUVEC感染Ad.GFP、Ad.NRP1或Ad-NRP1ΔC 48 h，并测定25 ng/ml VEGF对细胞迁移的影响。插图显示了NRP1和NRP1ΔC的表达水平。值(n个≥3）是平均值±SEM，表示为每个场迁移的细胞数量。*，P（P）< 0.05; **,P（P）<0.01（与Ad.NRP1加生长因子相比）。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Avraham，H.K.等人，2003年。血管内皮生长因子通过激活黏着斑激酶和相关黏着斑酪氨酸激酶调节人脑微血管内皮细胞的黏着斑驳集合。生物学杂志。化学。278:36661-36668.-公共医学
    1. Banerjee，S.等人，2006年。乳腺癌细胞分泌血小板衍生生长因子诱导的血管平滑肌细胞运动是通过神经纤维蛋白-1介导的。摩尔致癌物。45:871-880.-公共医学
    1. Cai，H.和R.R.Reed。1999.神经磷脂-1相互作用蛋白的克隆和表征：一种与神经磷脂-1细胞质结构域相互作用的PSD-95/Dlg/ZO-1结构域蛋白。《神经科学杂志》。19:6519-6527。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Chittenden，T.W.等人，2006年。合成素对动脉分支形态发生的选择性调节。开发小组10:783-795。-公共医学
    1. Defilippi、P.、P.Di Stefano和S.Cabodi。2006.p130Cas：信号网络中的一种多功能支架。细胞生物学趋势。16:257-263.-公共医学

出版物类型

MeSH术语