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.2011年3月4日；286(9):7629-40.
doi:10.1074/jbc。M110.208173。 Epub 2010年12月31日。

转录因子Nrf2（核因子红细胞2相关因子2）的乙酰化-去乙酰化调节其转录活性和核质定位

川井由美子 1, 拉基沙·加杜尼奥, 梅兰妮·西奥多, 杨建奇, 伊芬尼·J·阿伦泽
附属公司

转录因子Nrf2（核因子红细胞2相关因子2）的乙酰化-去乙酰化调节其转录活性和核质定位

川井裕美等。 生物化学杂志. .

摘要

通过共价修饰将Nrf2从其抑制剂蛋白Keap1中释放出来而激活Nrf2已被广泛报道。相比之下，从Keap1中释放后可能调节其作用的共价修饰很少受到关注。在这里，我们发现CREB结合蛋白诱导Nrf2乙酰化，增加了Nrf2与靶基因启动子中同源反应元件的结合，并增加了目标基因启动子的Nrf2依赖性转录。异源sirtuin 1（SIRT1）降低了Nrf2的乙酰化作用以及Nrf2依赖的基因转录，其作用被显性负SIRT1（SIRT1-H355A）所覆盖。SIRT1选择性抑制剂EX-527和烟酰胺刺激Nrf2依赖性基因转录，而白藜芦醇（SIRT1的假定激活剂）具有抑制作用，模仿SIRT1的作用。在Nrf2的Lys（588）和Lys（591）处将赖氨酸突变为丙氨酸或精氨酸，导致Nrf2依赖性基因转录降低，并消除CREB结合蛋白的转录激活作用。此外，SIRT1对这些突变体诱导的转录没有影响，表明这些位点是乙酰化位点。HepG2细胞中GFP-Nrf2的显微成像和Nrf2免疫印迹显示，乙酰化条件导致Nrf2核定位增加，而去乙酰化条件则增强其细胞质定位，而非核定位。我们假设细胞核中的Nrf2经过乙酰化，导致与碱性区亮氨酸拉链蛋白结合到抗氧化反应元件，从而进行基因转录，而脱乙酰化使其与抗氧化反应元件分离，从而导致转录终止，并随后导致其核输出。

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数字

图1。
图1。
CBP对Nrf2依赖性基因转录的影响。 A类，来自Gα的Nrf2依赖性转录i2类CBP增强基因启动子，E1A抑制基因启动子。K562细胞（1×105将细胞接种在1 ml培养基/孔中，接种在24孔板中24小时，分别用0.2μg空载体（pCI-Neo）或异源Nrf2（pCI/Nrf2）作为诱导剂和0.2μg pGα共同转染细胞i2类（−1214/+115）-luc，含或不含CBP表达质粒（0.2μg）或E1A表达质粒（0.3μg）。每个孔中的DNA总量为0.8μg；根据需要，使用空载体（pCMV5）将总数弥补到这个数量。转染24小时后收集细胞，测量启动子活性（28、31、32）。数据是来自四种不同细胞培养物的重复分析的平均值±S.E.。*，显著不同(第页<0.02）来自控制（仅矢量）；**，显著不同(第页<0.02）；***，显著不同(第页<0.02）来自Nrf2+CBP。B类，Nrf2诱导HO-1-ARE-luc和hNQO1号机组-美国海关与边境保护局（CBP）加强了ARE-luc记者，E1A则抑制了他们。HO-1-ARE-luc包含三个ARE拷贝（5′-CGGACCTTGACTCAGCAGAAAA-3′），克隆于小鼠HO-1最小启动子上游（−32到+72 bp）（29）。这个hNQO1型-ARE-luc（人类NAD（P）H:醌氧化还原酶1-ARE-luch）包含ARE的单一拷贝，来源于人类NQO1号机组启动子，位于包含与荧光素酶基因融合的TATA盒的最小启动子的上游（30）。所有质粒均以0.2μg转染，DNA总量调整为0.8μg，如A类。数据是四种不同细胞培养物重复分析的平均值±S.E.。*，显著不同(第页<0.05）来自控制（仅矢量）；**，显著不同(第页<0.02）来自Nrf2诱导的活性；***，显著不同(第页<0.01）。C类，用于荧光素酶分析的样品中Nrf2的全细胞含量，如所示B类用15μg蛋白质进行蛋白质印迹分析（10%SDS-PAGE）。使用抗Nrf2抗体检测Nrf2（sc-13032；Santa Cruz Biotechnology，Inc.）。同一印迹中的非特异性条带被用作负荷对照。所示的Western blot是来自三种不同细胞培养物的三个此类blot的代表。
图2。
图2。
在Nrf2诱导的基因转录过程中，Nrf2在细胞中乙酰化。K562细胞（8×105在8 ml培养基中）接种在T25烧瓶中。24小时后，用CBP表达质粒（1.6μg）转染细胞，转染细胞中含有或不含有E1A（1.6μc）(A类)或SIRT1（1.6μg），带有或不带有显性阴性SIRT1米)(B类)与0.2μg pCI-Nrf2一起培养24小时A类用曲古菌素A（66 n米)和NAM（10米米)收获前保持6小时，以抑制脱乙酰酶（33–35）。用免疫共沉淀法测定全细胞裂解物中的乙酰化反应。首先用抗Nrf2抗体（1μg，sc-13032；Santa Cruz Biotechnology，Inc.）沉淀整个细胞裂解物（200μg蛋白质），如“实验程序”所述，然后进行Western blotting(工作分解结构)IP样品，使用抗乙酰赖氨酸抗体（抗体9441；细胞信号技术）。中显示的污点A类和B类是三个不同实验的代表。C类CBP和SIRT1处理细胞中Nrf2的全细胞含量。用10μg蛋白质进行蛋白质印迹分析（8%SDS-PAGE）。使用抗Nrf2抗体检测Nrf2（sc-13032；Santa Cruz Biotechnology，Inc.）。同一印迹中的非特异性条带被用作负荷对照。所示的蛋白质印迹代表了三种这样的印迹。D类，SIRT1抑制Nrf2诱导的来自原型ARE驱动报告基因的转录。将0.2μg ARE驱动的报告基因最小启动子转染K562细胞HO-1型-ARE-luc、pCI-Nrf2（0.2μg）和携带野生型SIRT1 cDNA的质粒，无论是否带有显性阴性SIRT1（SIRT1-H355A）（0.2μc）。每个孔中的DNA总量为0.8μg，由添加空载体组成。转染24小时后收集细胞，如图1所示测量启动子活性。绘制的值是来自四种不同细胞培养物的重复分析的平均值±S.E.。*，显著不同(第页<0.05）。
图3。
图3。
SIRT1小分子调节剂对Nrf2依赖性基因转录的影响。在A类，K562细胞转染0.2μgHO-1型-ARE-luc报告子构建，以及0.3μg pCI-Nrf2或空载体（pCI-Neo）。24小时后，添加不同浓度的EX-527，2小时后收集细胞进行启动子分析（28、31、32）(左侧面板). 在B类，用NAM处理细胞（10 m米)并与用EX-527处理的细胞一起收获。数据是来自三种不同细胞培养物的重复分析的平均值±S.E。在C类，转染0.3μg gα的K562细胞i2类基因启动子结构（pGαi2类（−1214/+115）-luc）或0.2μgHO-1型-ARE-luc或hNQO1号机组-ARE-luc报告者在转染24小时后接受白藜芦醇治疗，然后t吨BHQ（20μ米)30分钟后。在添加t吨必和必拓。在D类，细胞分别转染0.2μg空载体pC1-Neo或异源Nrf2（pCI-Nrf2）作为诱导剂，以及0.3μg pGαi2类（−1214/+115）-luc，或每种0.2μgHO-1型-ARE-luc或hNQO1号机组-ARE-luc报告者在转染24小时后接受白藜芦醇治疗。加入白藜芦醇90分钟后，收集细胞进行启动子活性测定。在C类和D类，白藜芦醇对启动子活性的影响以百分比图表示，“无白藜芦醇处理”为100%。绘制的值是三个或四个实验的重复分析的平均值±S.E；误差线如果实验次数少于三次，则不显示。反对的论点，控制。
图4。
图4。
核提取物Nrf2-DNA结合活性的EMSA。 A类用pCI-Nrf2或pCI-Neo（对照）转染K562细胞。24小时后，将细胞在有或无条件下孵育1小时t吨BHQ（20μ米)在没有或有白藜芦醇（50μ米).B类，细胞与CBP表达质粒共转染，有或无E1A表达质粒；24小时后收集细胞A类和B类，制备核提取物并用于EMSA，如前所述（20、28、32），使用32P标记双链DNA探针5′-GCCCCCCCGGCCCAGTCA公司CAGGCTTGGTTC-3′，包含ARE（带下划线）基序，在Gα中映射为−84/−76i2类基因启动子。每个通道用2μg核提取蛋白进行反应。当使用抗体时，在添加每个抗体之前，将核提取物与标记探针在25°C下孵育30分钟，然后再孵育30min，然后进行电泳。针对Nrf2和小Maf（来自Santa Cruz Biotechnology，Inc.的Maf F/G/K（C-18））的抗体以2或4μG的剂量用于车道6和71或2μg车道8和9分别是。在2μg剂量下使用抗Sp1抗体。Nrf2-DNA结合复合物由箭头.未标记探针(11号车道)过量使用20倍。抗体、抗体；氖，核提取物；pCI-Neo公司，空向量；pCI-Nrf2型，Nrf2表达质粒。
图5。
图5。
突变（Lys→ Ala或Lys→ 赖氨酸的精氨酸591和赖氨酸588Nrf2的Neh3结构域中的残基损害ARE驱动报告基因的Nrf2依赖性反式激活。 A类，Nrf2的Neh1结构域外的假定乙酰化位点示意图，用乙酰化位点预测算法PAIL（60）进行识别。其中五个位点产生了赖氨酸到丙氨酸的替代突变(×)通过使用QuikChangeTM（TM）来自Stratagene（加州拉霍亚）的定点突变试剂盒和突变体用于转染实验B类在单独的实验中，赖氨酸转化为精氨酸（Lys→ 精氨酸）或赖氨酸转化为谷氨酰胺（赖氨酸→ 在Lys产生Gln）替代突变588和赖氨酸591并用于转染实验C类在瞬时转染试验中使用HO-1型-ARE-luc作为报告者构建（42）。所示值为四次重复分析的平均值±S.E(B类)或五个(C类)不同的实验。*，显著不同(第页<0.05）。
图6。
图6。
通过荧光成像评估Nrf2在细胞中的核质定位。HepG2细胞在六孔板盖玻片上生长至50-80%汇合处，然后用携带与Nrf2编码序列（EGFP-Nrf2，也称GFP-Nrf2）（20）相连的EGFP cDNA的质粒转染，然后用宽视野显微镜检查。A类，白藜芦醇对t吨BHQ诱导的GFP-Nrf2定位。白藜芦醇（50μ米)和/或t吨制动质量（20μ米)转染24h后加入细胞。在用白藜芦醇和t吨BHQ，白藜芦醇在添加t吨必和必拓。在添加t吨BHQ并进行荧光成像处理（20）。碘化丙锭(红色)用于对细胞核进行反染色。所提供的数据代表了三个实验。B类E1A诱导CBP处理细胞中GFP-Nrf2的细胞质定位。HepG2细胞按照A类转染1.5μg GFP-Nrf2(面板a)以及乙酰转移酶CBP（0.25μg）的表达质粒(面板b)或存在E1A表达质粒（0.25μg）(面板c)或E1A加LMB(面板d). 转染24小时后收集细胞并进行荧光成像（20）。收获前30分钟添加LMB（10 ng/ml）。所提供的数据是三种或四种不同文化的代表性结果。C类CBP使GFP-Nrf2的核荧光增强。绿色荧光强度的量化B类如前所述（20），使用尼康元素高级研究软件（纽约州梅尔维尔）进行。ResV（ResV），白藜芦醇。
图7。
图7。
通过Western blotting评估Nrf2在细胞中的核质分布。K562细胞（4×106/用4μg Nrf2表达质粒（pCI-Nrf2）或空载体（pCI-Neo）以及带有或不带有显性阴性SIRT1（SIRT1-H355A）（4μg）的SIRT1表达质粒转染8 ml的T25烧瓶），或用t吨BHQ（20μ米)在没有或存在小分子调节剂（1μ米EX-527或50μ米白藜芦醇）。使用时，在添加前30分钟添加EX-527或白藜芦醇t吨必和必拓。用10μg蛋白质进行蛋白质印迹分析（8%SDS-PAGE）。如前所述制备细胞质和细胞核组分（32）。使用抗Nrf2抗体检测Nrf2（sc-13032；Santa Cruz Biotechnology，Inc.）。A类SIRT1的小分子调节剂不会改变Nrf2的总细胞含量。B类，使用针对这些组分的蛋白质标记的抗体评估细胞质和核组分的相对纯度。核（p300/CβP-相关因子）和细胞质（β-微管蛋白）组分的标记用于评估两个组分之间潜在的交叉污染程度。C类和D类，核中Nrf2的相对含量(上部面板)和细胞质组分(下部面板)来自用SIRT1小分子调节剂处理的细胞(C类)或SIRT1表达质粒(D类). 蛋白质印迹分析（8%SDS-PAGE）采用每种组分10μg蛋白质进行。使用UN-SCAN-IT软件（Silk Scientific，Inc，Orem，UT）通过密度扫描对蛋白质印迹进行定量。计算结果与相应的载荷控制有关。将获得的比率绘制为直方图（三个或四个不同的实验），将空向量处理获得的比率设置为100%。D类，SIRT1诱导Nrf2核质分布的变化。C类，细胞质分数；W公司，全细胞裂解物；N个，核分数；尼奥，空向量（pCI-Neo）；编号2，pCI-Nrf2；ResV（ResV），白藜芦醇；dnSIRT1号机组，显性负SIRT1。
图8。
图8。
突变（Lys→ 赖氨酸的精氨酸591和赖氨酸588Nrf2 Neh3结构域中的残基改变GFP-Nrf2的核质定位。如图6的图例所示，将生长在六孔板盖玻片上的HepG2细胞与野生型pEGFP-Nrf2或Lys转染到50–80%的汇合处→ 精氨酸或赖氨酸→ 图5的图例中描述了Gln突变体。按照“实验程序”所述，对细胞进行荧光成像分析。为了染色细胞核，在室温下将细胞在3μg/ml碘化丙啶中培养2分钟，然后用PBS冲洗。然后使用Aqua/Polymount（Polysciences，Inc.Warrington，PA）将盖玻片安装在载玻片上，在4°C下过夜，在尼康TE2000-U C1共焦激光扫描显微镜下观察，激发/发射波长为488/505-550 nm（绿色荧光）和543/560-615 nm（红色荧光）。使用Adobe Photoshop，碘化丙啶的图像(圆周率)合并GFP荧光模式以可视化核定位。
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