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.2010年11月；177(5):2446-58.
doi:10.2353/ajpath.2010.100399。 Epub 2010年10月1日。

胰岛素样生长因子2受体是一种IFNgamma诱导的小胶质蛋白，促进细胞内HIV复制：对HIV诱导的神经认知障碍的影响

Hyeon-Sook Suh公司 1, 梅丽莎·科森扎·纳沙特, Namjong Choi先生, 赵梦亮, 李九凤, 杰弗里·波拉德, 兰迪·L·杰特尔, 哈里斯·戈尔茨坦, Sunhee C Lee公司
附属公司

胰岛素样生长因子2受体是一种IFNgamma诱导的小胶质蛋白，促进细胞内HIV复制：对HIV诱导的神经认知障碍的影响

Hyeon-Sook Suh公司等。 美国病理学杂志. 2010年11月.

摘要

胰岛素样生长因子2受体（IGF2R），也称为阳离子非依赖性甘露糖6-磷酸（M6P）受体，是一种跨膜糖蛋白，定位于转高尔基区，参与将M6P携带酶和IGF2靶向溶酶体室。在发育过程中，IGF2R在清除组织和血液中多余的生长因子方面发挥着关键作用。由于全球Igf2r敲除的围产期致死性，Igf2r在成人中的功能，特别是在中枢神经系统中的功能尚不清楚。我们进行了一项新的观察，即IGF2R在HIV脑炎患者大脑中的小胶质结节中高度表达。在体外，在检测的几种细胞因子和TLR配体中，IFNγ独特地增强了小胶质细胞IGF2R的表达。此外，在一些HIV感染的体外模型中，包括人类和小鼠小胶质细胞、巨噬细胞和非巨噬细胞，IGF2R被反复证明是HIV感染的阳性调节器。IGF2R RNAi还下调HIV感染的人类小胶质细胞中IP-10趋化因子的产生。将VSVg-env-HIV注射到小鼠脑内可诱导神经元表达HIV p24，这是成人脑中唯一正常表达IGF2R的细胞类型。我们的结果表明IGF2R作为一种诱导性小胶质蛋白在调节HIV和趋化因子表达中具有新的作用。具有Csf1r驱动的Igf2r基因敲除的小鼠应该有助于研究巨噬细胞特异性Igf2r功能。

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数字

图1
图1
HIVE中巨噬细胞和小胶质细胞中IGF2R的表达上调。用兔抗牛IGF2R抗体研究IGF2R在死后人脑切片中的表达。答：所有病例均表现出神经元IGF2R表达，无论其HIV状态如何（显示为HIV−).B类：HIV白质−和HIV+(插入)脑部IGF2R染色很少或没有，而血管内的白细胞呈阳性。抄送：HIVE患者表现出丰富的IGF2R染色，尤其是在HIV感染区域（小胶质结节）。大多数IGF2R+细胞形态为小胶质细胞和巨噬细胞。医生：HIVE中的一些反应性星形胶质细胞也呈阳性(箭头).电子邮箱：使用图像分析计算机程序（NIH ImageJ）分析一组病例的IGF2R免疫反应面积百分比。艾滋病咨询门诊+病例和HIV−免疫反应水平明显较低(P（P）<0.001）与HIVE病例相比。虽然有感染艾滋病毒的趋势+例免疫反应水平略高于HIV−，这并没有达到意义。方框中的线表示中值，胡须表示范围。该框指示四分位数（第25和75位）。比例尺：50μm(A–D). ***P（P）< 0.001.
图2
图2
HIVE中IGF2R和细胞/病毒标记物的双重免疫标记。确认IGF2R的身份+细胞，进行一系列胶质标记物的双重免疫组化。用二氨基联苯胺（棕色）标记IGF2R，用硝基蓝四氮唑（蓝色）标记细胞特异性标记物。答：CD68双标记显示血管外有许多双阳性细胞。它们有巨噬细胞的形状。还要注意左侧血管内的一簇较小的阳性细胞。CD68-/IGF2R+单元格(箭头)附近有星形胶质细胞的形状。B类：用抗CD45RB标记该小胶质结节中的许多加工性小胶质细胞和一些圆形巨噬细胞。CD45的一个子集+细胞也是IGF2R+.抄送：用HIV-1 p24抗体染色显示，在这个领域有许多双标记的加工细胞。医生：GFAP和IGF2R双重标记显示GFAP+星形胶质细胞通常对IGF2R不呈阳性(E类,F类、和G公司)多核巨细胞共表达IGF2R（胞内）和标记物CD68（胞内的）、CD45（细胞膜）和HIV-1 p24（胞内内的）的高倍图像。高：罕见IGF2R的高倍视图+/GFAP公司+星形胶质细胞显示两种染色质的亚细胞定位不同。比例尺：50μm(A–D); 20微米(E–H（E–H）).
图3
图3
IGF2R在MeWo细胞中HIV表达中的作用。稳定表达IGF2R siRNA（KD）的MeWo细胞（人类黑色素瘤细胞系）和对照细胞（WT）感染HIV-携带的VSVg环境价值(A类和B类)或嵌合环境（均为HIV−和VSVg环境价值:C类和天)，如中所述材料和方法.A类和B类：Western blot检测HIV gag表达量。三种分离培养物的密度比显示，与WT细胞相比，IGF2R siRNA（KD）对MeWo细胞中HIV gag的表达有显著抑制作用（平均值±SEM，P（P）< 0.05t吨-测试）。M6P（10 mmol/L）处理WT细胞可能通过上调IGF2R而增加HIV表达（尽管不显著）。C类和医生：电子显微镜下，感染HIV的MeWo细胞显示HIV颗粒(箭头)在细胞突起附近的细胞外空间具有特征性的形态（偏心核、不规则形状和大小）。尽管与WT培养基相比，kDa培养基中的病毒粒子出现频率较低，但在病毒粒子形态上没有发现差异。高功率视图位于面板下方天. *P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01.
图4
图4
IFNγ上调小胶质细胞中IGF2R的表达。答：通过双重免疫荧光显微镜（CD45红色；IGF2R绿色）检测培养的原代人胎儿小胶质细胞的IGF2R表达。他们表现得很典型反式-IGF2R表达的高尔基体分布。B类：如文中所述，通过Western blot和密度分析比较模拟或HIV感染的小胶质细胞培养物中IGF2R的表达。HIV感染的小胶质细胞中IGF2R水平略有下降，但这一差异并不显著(P（P）> 0.05,n个= 3).抄送：用各种细胞因子（10 ng/ml）或TLR配体（100 ng/ml的LPS；20μg/ml的PIC=poly-IC）刺激小胶质细胞24小时，然后对IGF2R进行Western blot分析，如材料和方法将对照小胶质细胞培养物（n≥3）中的IGF2R水平正常化后，比较与看家蛋白（vinculin或β-actin）的密度比。平均值±SEM*P（P）<0.05，用Dunnett的后验进行方差分析。医生：小胶质细胞培养物接受与C类除用Q-PCR检测IGF2R表达外。平均值±SEM**P（P）< 0.01.
图5
图5
IGF2R siRNA减少人类小胶质细胞中HIV感染和IP-10的产生。答：将IGF2R siRNA或对照siRNA以10 nmol/L转染原代人小胶质细胞培养物5天，然后感染VSVg环境价值HIV感染时间延长3-4天。免疫荧光显微镜显示，与对照组相比，特定siRNA处理的培养物中IGF2R的表达（红色）降低。在这些培养物中，通过p24免疫染色（免疫过氧化物酶法，紫色）测定，HIV gag表达也降低。B类：定量ImageJ分析显示IGF2R siRNA处理的小胶质细胞培养物中p24显著抑制（平均值±SEM，P（P）< 0.05t吨-试验）感染两种不同剂量的病毒。抄送：用IGF2R siRNA处理并感染HIV的小胶质细胞培养物中HIVgag和IGF2R mRNA的Q-PCR分析A类IGF2R RNAi显著降低IGF2R表达并抑制HIV表达*P（P）< 0.05, ***P（P）< 0.001 (t吨-测试）医生：用ELISA检测经IGF2R siRNA处理并感染HIV的小胶质细胞培养物中趋化因子IP-10和IL-8的产生A类IGF2R RNAi显著降低了IP-10而非IL-8的产生(*P（P）< 0.05,n个= 3,t吨-测试）。
图6
图6
的特征Csf1r-Igf2rKO小鼠（Iba-1免疫组织化学）。Iba-1（巨噬细胞标记物）免疫组织化学用于检测WT大鼠大脑、脾脏和肝脏中的组织巨噬细胞数量(左边 柱)和KO(正确的 柱)老鼠。在大脑中，Iba-1染色精细的分支小胶质细胞，而在脾脏中，白髓和红髓中都存在大量阳性细胞。肝脏枯否细胞阳性。ImageJ对三只小鼠的形态分析显示，Iba-1染色的数量没有差异。这些结果表明Csf1r公司-驱动免疫球蛋白2r缺失并没有显著改变组织巨噬细胞。
图7
图7
的特征Csf1r-Igf2rKO小鼠（IGF2R免疫组织化学）。在大脑中，IGF2R免疫反应仅在神经元中观察到，WT和KO之间没有明显差异（cbl：小脑，Hp：海马，Cx：皮层和脑干）。脾脏中IGF2R免疫反应细胞极少，而肺部支气管上皮细胞、肺泡隔和巨噬细胞中IGF2R-免疫反应较强。总之，这些结果表明，在正常条件下，IGF2R主要在非巨噬细胞群体中表达。WT和WT之间的IGF2R免疫反应性没有明显差异Csf1r公司-驱动免疫球蛋白2rKO小鼠。
图8
图8
的特征Csf1r-Igf2rKO小鼠（大脑和脾脏组织的Q-PCR）。通过大脑的Q-PCR进行进一步的定量基因表达分析(A类)和脾脏(B类)组织。KO小鼠脾脏（而非大脑）IGF2R mRNA显著降低(*P（P）< 0.05,t吨-测试）。两个器官中的Iba-1水平没有差异（bars=平均值）。对额外IGF家族和相关蛋白的分析表明，IGF1在KO小鼠脾脏中显著降低（未显示）。包括GFAP和MPRcd在内的脑部变化均无显著性。
图9
图9
HIV在小鼠巨噬细胞中的复制Csf1r-Igf2rKO小鼠。从WT或KO小鼠中分离出骨髓源性巨噬细胞（BMDM），并在M-CSF存在下培养，如材料和方法.巨噬细胞感染了VSVg环境价值HIV感染4天，然后通过Q-PCR分析HIV gag和IGF家族及相关蛋白。KO巨噬细胞中IGF2R和HIV gag的转录水平显著降低(**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001). IGF1R、IGF1、MPRcd和Iba-1没有显著改变。未检测到IGF2（未显示）。
图10
图10
HIV在小鼠小胶质细胞和星形胶质细胞中的复制Csf1r-Igf2rKO小鼠。小胶质细胞(A类)和星形胶质细胞(B类)按照材料和方法然后进行HIV感染和Q-PCR分析，如图9图例所示。结果表明，小胶质细胞而非星形胶质细胞Csf1r-Igf2r与WT细胞相比，KO小鼠IGF2R表达和HIV gag表达降低**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.
图11
图11
WT和WT中的HIV p24Csf1r-Igf2r接种VSVg的KO小鼠脑环境价值艾滋病毒。注射VSVg的小鼠脑组织环境价值7天后对HIV gag（p24）进行免疫染色。在WT和KO小鼠的大脑中，只有针道沿线的神经元对p24呈阳性反应(顶部 面板). 注意线性针迹(顶部 正确的). 通过neuN（神经元细胞核：棕色）和HIV p24（细胞质：蓝色）的双标记免疫组织化学证实了HIV感染细胞的神经元特性(插入,顶部 正确的). 远离注射部位和未注射大脑中的神经元p24为阴性(底部 左边). 由于存在对二级抗体反应的小鼠IgG，小鼠大脑中的血管呈阳性。HIV p24的对照组包括患有HIV脑炎的人脑（小胶质细胞和多核巨细胞阳性）和正常的HIV（−）脑（无反应性）(底部 正确的 面板). 用苏木精对所有单独标记的切片进行轻微复染。
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