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.2010年10月；17（10）：1247-54。
doi:10.1038/nsmb.1915。 Epub 2010年9月26日。

乳腺癌蛋白PALB2和短小杆菌BRCA2在刺激同源重组中的协同作用

雷米·布森 1, 安妮·马里·迪翁-科特, 阎库伦, 赫莱娜·拉奈, 洪才, Alicja Z Stasiak公司, 安德烈·斯塔西亚克, 冰霞, Jean-Yves Masson女士
附属公司

乳腺癌蛋白PALB2和短小杆菌BRCA2在刺激同源重组中的协同作用

雷米·布森等。 自然结构分子生物学. 2010年10月.

摘要

人类PALB2的遗传突变与乳腺癌和胰腺癌的易感性有关。PALB2的肿瘤抑制作用被认为是基于其促进BRCA2在同源重组中的功能的能力。然而，PALB2的生化特性尚不清楚。在这里，我们显示人类PALB2优先结合DNA（D-loop结构），并直接与RAD51重组酶相互作用以刺激链侵入，这是同源重组的关键步骤。这种刺激通过加强生化机制发生，因为PALB2减轻RPA的抑制并稳定RAD51纤维。此外，PALB2可以与BRCA2嵌合体（称为piccolo或piBRCA2）协同作用，进一步促进链侵袭。最后，我们表明PALB2缺陷细胞对PARP抑制剂敏感。我们的研究首次用piBRCA2作为DNA双链断裂修复中同源重组的介体，对PALB2的功能进行了生化研究。

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数字

图1
图1。纯化的PALB2结合DNA
（a） 纯化PALB2蛋白的SDS-PAGE。左：1号通道，精密加分子量标记（BioRad）；通道2，净化PALB2（500 ng）。（b） PALB2优先绑定D环。在8%丙烯酰胺凝胶上用PALB2（0.5–20 nM）和D-loop、dsDNA（ds）和ssDNA（ss）（2–7道）或Holliday接头（HJ）、张开臂（SA）、dsDNA和ssDNA底物（9–14道）进行竞争电泳迁移率变化分析。通道1和通道8，不含蛋白质。（c） 电泳迁移率变化分析的量化。（d） PALB2-ssDNA蛋白复合物与PALB2抗体（第3道）或对照IgG（第4道）超移，并在0.8%琼脂糖凝胶上进行分析。通道1和通道5，单独用DNA控制或分别用PALB2抗体培养。（e） PALB2（40 nM）在线性DNA分子（约3900 bp）上形成的复合物的电子显微镜，每个末端（约200 nt）含有3’单链尾部。插入：缺少DNA的PALB2特写。86%的DNA分子两端结合，而14%的分子一端结合。
图2
图2。PALB2刺激RAD51链交换和DNA捕获
（a） PALB2刺激RAD51介导的链交换。RAD51和/或PALB2与1.5µM 63-mer ssDNA混合。通过添加同源的3µM 63-bp dsDNA启动DNA链交换，其中在DNA链交换过程中被置换的链为32P标记。（b） 左：第二个捕获策略的方案；右图：使用PALB2和/或RAD51进行第二次捕获分析。将指示浓度的PALB2或/和RAD51与含有1µM 5'-生物素化ssDNA poly dT的珠培养。然后将300 nM的非同源dsDNA添加到DNA-蛋白质复合物中。珠状物和上清液被分离、洗涤并用SDS处理以洗脱结合蛋白，并用聚丙烯酰胺凝胶进行分析。
图3
图3。PALB2直接与RAD51交互
（a） 右图：PALB2缺失变体与GST和RAD51 GST融合的方案。左：相应纯化蛋白的SDS-PAGE（b）GST单独或从细菌中纯化的GST-标记的PALB2片段与RAD51孵育，并使用谷胱甘肽sepharose珠捕获蛋白复合物。用SDS清洗和处理珠子以洗脱结合蛋白，并通过RAD51的western blotting显示。（c） 单独GST或GST标记的RAD51片段与/不与PALB2孵育，然后使用PALB2抗体进行免疫沉淀分析，并通过针对PALB2和GST的western blotting显示。（d） 用抗IgG或抗组氨酸标签抗体对纯化的PALB2截短物（P2T1或P2T5）和RAD51截短体（R51T3）进行共免疫沉淀，然后用抗GST抗体进行免疫印迹。（e） 纯化PALB2和RAD51的共免疫沉淀。使用抗PALB2的多克隆抗体进行免疫沉淀，并对PALB2和RAD51进行印迹，如图所示。
图4
图4。PALB2通过两个不同的结构域结合DNA并刺激RAD51介导的D-loop形成
（a） 在8%丙烯酰胺凝胶上，使用GST裂解的PALB2截短物（300 nM）和D-loop、dsDNA（ds）和ssDNA（ss）（2-6道）或Holliday连接物（HJ）、张开臂（SA）、dsDNA和ssDNA底物（9-13道）进行竞争电泳迁移率变化分析。（b） PALB2截断P2T1和P2T3（40 nM）在线性DNA分子上形成的复合物的电子显微镜，线性DNA分子每端含有约200个核苷酸的3'单链尾部。（c，d）由RAD51（300 nM（c）或400 nM（d））或PALB2单独（2–3道）介导的d-loop反应，或RAD51和PALB2（4至8道）与（a）1µM 100聚体单链DNA寡核苷酸的组合。底部：结果的量化。（d） 与1µM线性DNA分子的d-loop反应，其中每端含有约200个核苷酸的3'-单链尾部。底部：结果的量化。带星号的带对应于退火尾分子。
图5
图5。BRCA2嵌合蛋白（piccolo BRCA2）概括了人类BRCA2的特性
（a） BRCA2嵌合体包含PALB2结合结构域（氨基酸1-40）、BRC3和BRC4重复序列（氨基酸1409-1596）、三个OB折叠（氨基酸2477至3194）和TR2重复序列（氨基酸3265至3330）。（b） piBRCA2与γ-H2AX和PALB2共定位，形成独特的I-SceI DNA双链断裂。用pCBASce（编码I-SceI）转染含有DR-GFP的DR95细胞，并用指示的抗体进行免疫荧光。所有piBRCA2转染细胞均与γ-H2AX共定位。（c-d）piBRCA2与PALB2和RAD51相互作用。（c） 用表达piBRCA2-Flag的质粒转染HEK293T细胞，或（d）表达piBRCA 2-Flag和PALB2-Flag或缺乏与BRCA2相互作用域（WD40重复）的PALB2的质粒。制备全细胞提取物，并单独使用IgG、抗标记或抗PALB2抗体进行免疫沉淀，然后用指示的抗体进行免疫印迹。（e） 在piBRCA2存在的情况下，RAD51的核定位得以恢复。用抗BRCA2的siRNA转染Hela细胞，并用或不用表达piBRCA2-Flag的质粒转染。细胞被分为细胞溶质和染色质组分，并通过Western blotting分析piBRCA2和内源性BRCA2及RAD51的存在。针对GAPDH和组蛋白H3的免疫印迹分别是细胞溶质和染色质部分的阳性对照。（f） piBRCA2克服了RPA抑制，促进RAD51组装。与ssDNA寡核苷酸结合的RPA可阻止RAD51组装（第2通道），而添加piBRCA2可在存在RPA的情况下刺激RAD51纤维形成（第3通道至第7通道）。缺乏ATP和Mg时刺激较弱2+（车道8）。通道9-11，仅珠子上RPA、RAD51和PALB2的相互作用。
图6
图6。BRCA2嵌合体刺激RAD51介导的D-loop形成，并与PALB2协同作用，促进D-loop的形成
（a） 纯化piBRCA2蛋白（300 ng）的SDS-PAGE。左：1号通道，精密加分子量标记（BioRad）；车道2，净化piBRCA2。（b） 用piBRCA2（0.5–20 nM）和D-loop、dsDNA（ds）和ssDNA（ss）（2–7道）或Holliday接头（HJ）、张开臂（SA）、dsDNA和ssDNA底物（9–14道）进行电泳迁移率变化分析，并在8%丙烯酰胺凝胶上迁移。通道1和通道8，不含蛋白质。最右边：DNA结合百分比的量化。（c） piBRCA2在RAD51催化的D环形成中的作用。仅含DNA的反应（通道1）；piBRCA2（70 nM，车道2）；RAD51（400 nM，车道3）；或在含有3’单链尾的线性DNA分子上，将两种蛋白质（4–10道）与1µM结合。右：结果的量化（d）PALB2（30–40 nM）与piBRCA2（15–20 nM）协同工作，以刺激d-loop反应中的RAD51（400 nM）。右：量化结果。面板c和d中用星号表示的带对应于退火尾分子。
图7
图7。PALB2是保护RAD51灯丝不被拆卸的HR调节剂
（a） 与ssDNA寡核苷酸结合的RPA可阻止RAD51组装（通道2），而添加PALB2可在存在RPA（通道3至7）但不存在ATP和Mg的情况下刺激RAD51纤维的形成2+（车道8）。通道9-11，RPA、RAD51和PALB2在珠上的相互作用（b）左侧，纯化BRC3/4-GST多肽（1µg）的SDS-PAGE，对应于BRCA2的BRC3和BRC4区域（氨基酸1409-1596）。车道1，精密加分子量标记（BioRad）；通道2，纯化BRC3/4-GST（1µg）。对，BRC3/4-GST多肽抑制RAD51–DNA复合物的形成。在添加BRC3/4-GST（通道5-8）之前，将纯化的RAD51蛋白与100个单链DNA寡核苷酸（通道4）孵育。车道3，DNA单独；泳道9，与DNA孵育的BRC3/4-GST。（c） PALB2或piBRCA2保护D环形成免受BRC3/4-GST多肽的影响。在添加BRC3/4-GST多肽之前，用RAD51-3’tail DNA复合物培养RPA（5到8道）、PALB2（9到12道）和piBRCA2（13到16道）。带星号的带对应于退火尾分子。（d） RPA、PALB2或piBRCA2与BRC3/4-GST多肽存在时相对d-loop形成。（e） 野生型淋巴母细胞（FEN5280）、EUFA1341（表达PALB2 Y551X）和EUFA1341+单独载体（pOZC）或PALB2到PARP抑制剂（AZD2281）的存活曲线。通过ATP水平定量分析细胞存活率。
图8
图8
模型。PALB2和BRCA2协同工作以刺激同源重组。在DNA被MRN/CtIP损伤和切除后，PALB2-BRCA2激活RAD51以促进未受损模板的入侵，导致合成依赖性链退火或第二末端捕获和双Holliday结形成，以允许DSB修复。
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    1. Jemal A等人，《癌症统计》，2009年。CA癌症临床杂志。2009-公共医学
    1. Gudmundsdottir K，Ashworth A.BRCA1和BRCA2及其相关蛋白在维持基因组稳定性中的作用。致癌物。2006;25:5864–5874.-公共医学
    1. Venkitaraman AR。将BRCA基因的细胞功能与癌症发病机制和治疗联系起来。《病理学年鉴》。2009;4:461–487.-公共医学
    1. 重组蛋白及其控制的分子观点。Nat Rev Mol细胞生物学。2003;4:435–445.-公共医学
    1. Davies AA等。BRCA2在控制RAD51重组和DNA修复蛋白中的作用。分子细胞。2001;7:273–282.-公共医学

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