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.2010年10月5日；107（40）：17333-8。
doi:10.1073/pnas.1007765107。 Epub 2010年9月20日。

单核细胞增生李斯特菌InlC蛋白通过靶向I{kappa}B激酶亚单位IKK{α}

伊迪丝·古因 1, 米诺Adib-Conquy, 达米安·巴列斯特里诺, 玛丽安娜霍里, 维罗尼克·维利尔斯, Frédéric Colland餐厅, 沙诺尔·德拉姆西, 奥利维尔·杜斯库特, 帕斯卡尔·科斯特
附属公司

单核细胞增生李斯特菌InlC蛋白通过靶向I{kappa}B激酶亚单位IKK{α}

伊迪丝·古因等。 美国国家科学院程序. .

摘要

单核细胞增多性李斯特菌是一种引起严重食源性感染的细胞内病原体。它可以在吞噬细胞和非吞噬细胞哺乳动物细胞中复制。细胞水平的感染过程已被广泛研究，但细菌如何克服早期宿主固有免疫反应仍不清楚。在这里，我们表明，InlC是内部蛋白家族的一员，在细胞内分泌，并与IKKα直接相互作用，IKK是IκB激酶复合物的一个亚单位，对IκB的磷酸化和NF-κB的激活至关重要，NF-κ子B是先天免疫反应的主要调节器。用WT李斯特菌或inlC缺失突变体进行感染实验，并用inlC转染细胞，结果表明inlC的表达会损害磷酸化，从而延迟经典NF-κB刺激物TNF-α通常诱导的IκB降解。此外，与WT相比，inlC突变株感染RAW 264.7巨噬细胞导致促炎细胞因子的产生增加。最后，在腹膜炎小鼠模型中，我们发现，与WT感染相比，感染inlC突变体会导致腹腔内趋化因子的产生增加，中性粒细胞的募集增加。总之，这些结果表明，inlC通过与IKKα相互作用，抑制了李斯特菌在感染过程中诱导的宿主固有反应。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
InlC结合IKKα。(A类)InlC的示意图，这是一种包含一个信号肽（SP）、六个LRR和一个Ig样结构域的蛋白质。(B类)感染HeLa细胞中InlC和LLO表达动力学。Western blot使用抗InlC、抗LLO和抗肌动蛋白抗体分析感染后不同时间点的总细胞提取物。肌动蛋白被用作蛋白质的负荷控制。(C类)转染HEK-293 T-REx细胞中IKKα与InlC的相互作用。用抗InlC抗体对未转染或转染所示质粒（InlC c-Myc、IKKα-HA）的HEK-293 T-REx细胞的全细胞裂解物进行免疫沉淀，然后用抗c-Myc和抗-HA抗体进行免疫印迹。抗IKKα和抗IKKβ抗体的Western blot分析显示内源性IKKβ和IKK。(D类)用免疫荧光法检测感染WT株3h的HeLa细胞中的InlC。肌动蛋白用Alexa Fluor 488-共轭的卵磷脂标记。用抗InlC抗体检测InlC，用抗-李斯特菌属抗体。
图2。
图2。
InlC延缓感染细胞中IκBα的降解。HeLa细胞未感染或感染单核细胞增生李斯特菌WT或Δ英寸C突变型（Δ英寸C)和补码-Δ英寸C突变型（ΔinlC+inlC)在刺激后的指定时间点，用TNF-α（10 ng/mL）刺激进行裂解。用识别磷酸化IκBα的抗体对提取物进行免疫印迹分析(A类)和IκBα(B类). 使用肌动蛋白抗体复制膜，以控制负荷。NS，非刺激性。
图3。
图3。
InlC可阻止NF-κB-65向感染细胞的细胞核移位。(A类)HeLa细胞未感染或感染单核细胞增生李斯特菌WT，Δ英寸C突变型（Δ英寸C)，或补码-Δ英寸C突变型（ΔinlC+inlC)用TNF-α（50 ng/mL）刺激30分钟，固定，并通过免疫荧光用DAPI标记细胞核和细菌，抗InlC抗体检测细胞细胞质中InlC的分泌，抗p65识别NF-κB亚基。(B类)量化中显示的结果A类NF-κB（P65）的核转位百分比通过至少100个未感染或WT、Δ英寸C，或Δ英寸C+英寸C用荧光显微镜观察感染细胞。实验进行了两次，并给出了典型结果***P（P）< 0.0005, χ2测试。
图4。
图4。
InlC抑制NF-κB调节启动子的激活。HEK-293 T-REx细胞与不同质粒、NF-κB依赖荧光素酶报告子、pRL-Tkluc和pCDNA4共同转染-英寸C或pCDNA4-lacZ公司按每口井的指示量。然后用TNF-α（10 ng/mL）刺激细胞。萤火虫荧光素酶活性与Renilla荧光素酶活性标准化。条形图显示与未刺激细胞相比的折叠诱导。数值为六口井的平均值±SD。每个实验重复三次***P（P）<0.0005，韦尔奇t吨测试。NS，不显著。
图5。
图5。
InlC在体外会削弱促炎反应。RAW264.7细胞感染单核细胞增生李斯特菌WT，Δ英寸C突变体或补体Δ英寸C突变型（ΔinlC+inlC)（内政部10)在指定的时间点，用ELISA测定上清液中IL-6和TNF-α的水平。将暴露于LPS（50ng/mL）的RAW264.7释放的细胞因子用作阳性对照（数据未显示）。数值为平均值±SEM；n个= 6. *P（P）< 0.01; **P（P）< 0.005; ***P（P）<0.0005，学生t吨测试。
图6。
图6。
InlC调节体内炎症过程。(A类)小鼠腹腔接种PBS或单核细胞增生李斯特菌WT（EGD），Δ内部控制突变体或补体Δ英寸C突变型（ΔinlC+inlC)在感染后12 h用ELISA法测定腹腔灌洗液中KC和MIP1α的水平。(B类)用流式细胞仪对腹腔灌洗液中的白细胞进行造粒和处理，并测定中性粒细胞（PMN）的数量。数值为平均值±SEM；n个= 6. *P（P）< 0.01; **P（P）< 0.005; ***P（P）<0.0005，学生t吨测试。
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