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.2010年8月13日；39(3):333-45.
doi:10.1016/j.molcel.2010.07.021。

通过复制蛋白A复合体的去SUMO和SUMO化调控DNA修复

红豆 1, 朝皇, 梅丽莎·辛格, 菲利普·卡彭特, 爱德华·T·H·Yeh
附属公司

通过复制蛋白A复合体的去SUMO和SUMO化调控DNA修复

红豆等。 分子电池. .

摘要

复制蛋白A复合体（RPA）在DNA复制和损伤反应中起着至关重要的作用。然而，尚不清楚该复合物是否受SUMO酰化途径调控。在这里，我们表明RPA（RPA70）的70kDa亚单位与细胞核中的Sentrin/SUMO特异性蛋白酶SENP6结合，在S期将RPA70维持在低SUMO化状态。Campothecin（CPT）是复制应激的诱导物，它将SENP6从RPA70中解离出来，使RPA70被一个小的泛素样修饰物2/3（SUMO-2/3）修饰。RPA70 SUMO化促进Rad51向DNA损伤灶募集，通过同源重组（HR）启动DNA修复。表达不能被氨酰化的RPA70突变体的细胞株在HR中有缺陷，并且对CPT的敏感性显著增加。这些结果表明，RPA70的SUMO化状态在通过同源重组调控DNA修复中起着关键作用。

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数字

图1
图1。SENP6在S阶段与RPA70关联
（A） SENP6的结合域与RPA70的映射。如图所示，用2µg c-Myc标记的RPA70和2µgFLAG标记的全长或截短的SENP6共同转染HEK-293细胞。标记的RPA70通过抗c-Myc亲和矩阵沉淀，并用抗FLAG抗体进行免疫印迹（上面板）。使用抗FLAG（中面板）和抗c-Myc（下面板）抗体进行免疫印迹，以确保在免疫沉淀前裂解液中存在等量的截短SENP6，或用作IP Western的负荷控制。抗c-Myc样本（下面板）来自IP。FL：全长，T1:SENP6（1-974）；T2:SENP6（1-777）；T3:SENP6（1-629）；T4:SENP6（1-379）。（B） S期细胞中RPA70和SENP6的共定标。按照之前描述的程序，HeLa细胞在有丝分裂中同步化（Dimitrova等人，1999年）。在下一个细胞周期中释放中期细胞，并在4小时后（G1期）收集等分细胞，或按照方法中所述通过双胸腺嘧啶核苷块在G1/S期边界同步，然后在游离培养基中释放3小时（S期）和9小时（G期）2/M相）。G1期和S期细胞经Triton提取、固定，并染色以检测所示抗体。对于G中的细胞2/M、 将第二次胸苷阻断释放9小时的细胞进行胰蛋白酶化、CSK提取、固定，并将其胞浆固定在载玻片上进行免疫染色。显示了细胞周期不同阶段的典型图像。SENP6（绿色）、RPA70（红色）或PCNA（红色）。SENP6与RPA70或PCNA的共定标以黄色显示。（C） SENP6在S阶段与RPA70相关联。HeLa细胞通过双胸苷块进行同步化，并在指定时间收获。内源性SENP6与抗RPA70多克隆抗体共沉淀，并与抗SENP6抗体进行免疫印迹（上表）。用抗RPA70单克隆抗体标准化沉淀RPA70的输入（中间面板）。用抗SENP6单克隆抗体免疫印迹法确认WCL中的内源性SENP6（下表）。插入框显示了从双胸苷块释放后不同时间的细胞周期曲线。
图2
图2。SENP6调节RPA70的SUMO化
（A） SENP6-敲除诱导RPA70 SUMO化。转染指示的siRNA后72小时制备细胞裂解物，用SDS-PAGE分离，并用抗RPA70单克隆抗体进行免疫印迹。显示了两种不同的曝光。（B） 内源性SUMO-2/3修饰内源性RPA70体内方法中描述了SENP6-敲除。将细胞裂解液平均分配，以通过对照IgG或RPA70单克隆抗体进行免疫沉淀。用抗SUMO-1或抗SUMO-2/3抗体免疫印迹内源性SUMO化RPA70。负载样品通过用抗RPA70单克隆抗体印迹进行标准化。（C） RPA70在过表达系统中被SUMO-2修饰。用显示的c-Myc标记的RPA70（2.5 ug）和HA标记的SUMO-2（0.5 ug）质粒转染COS-1细胞。转染24小时后用Myc-EZview™红色亲和凝胶基质进行免疫沉淀，并用c-Myc（上面板）或HA抗体（下面板）进行分析。（D） SENP6的过度表达使磺胺酰化RPA70去结合。用c-Myc标记的RPA70（2.0µg）、HA标记的SUMO-2（0.5µg。沉淀标记的RPA70，并用抗HA（上面板）或抗c-Myc抗体（中面板）进行免疫印迹。SENP6的表达通过抗FLAG抗体免疫印迹证实（下表）。SENP6的过度表达可能导致非特异性切割。然而，图2A和B所示的siRNA敲除研究显示了SENP6的真正特异性。（E）RPA70中SUMO化位点的测定。用2.0µg c-Myc标记的RPA70或其突变体以及HA-SUMO-2质粒转染COS-1细胞。c-Myc标记的RPA70的免疫沉淀物用抗HA（上面板）或抗c-Myc抗体（下面板）进行免疫印迹。
图3
图3。CPT诱导SENP6与RPA70分离及RPA70的SUMO化
（A，B）RPA70对CPT的SUMO反应。异步HeLa细胞用不同浓度的CPT（A）处理或在CPT处理后的指定时间点收集（B）。用抗RPA70、抗γ-H2AX或抗肌动蛋白抗体对全细胞裂解物进行免疫印迹分析。（C） CPT诱导RPA70与SENP6分离。用兔抗RPA70多克隆抗体或对照IgG免疫沉淀内源性RPA70，用抗SENP6（上面板）或抗RPA七十（中面板）单克隆抗体免疫印迹。用抗SENP6抗体印迹WCL（下面板）。（D） CPT调节染色质上的SENP6/RPA70结合和RPA70 SUMO化。按方法所述制备经CPT处理不同时间的HeLa细胞的染色质组分。染色质相关SENP6和RPA70通过微核核酸酶释放，用抗SENP6抗体或对照IgG免疫沉淀，用抗RPA70（上面板）或抗SENP 6抗体免疫印迹（第二面板）。染色质部分也用抗SENP6（第三组）、抗RPA70（第四组）或抗组蛋白H3（最低组）进行免疫印迹。
图4
图4。RPA70（ΔSUMO）增加了对CPT治疗的敏感性
（A） 稳定的siRNA-resistant FLAG-tagged RPA70细胞的建立。这是通过用PQCXIP载体感染HeLa细胞来稳定表达FLAG标记的、siRNA抗性的FLAG标记的RPA70（WT）或RPA70（ΔSUMO）来实现的。FLAG-tagged RPA70（WT）或RPA70的表达水平与内源性RPA70相似。（B） 用50nM siRNAs转染敲除内源性RPA70，用RPA70单克隆抗体分析细胞裂解产物。通过肌动蛋白免疫印迹对装载样品进行标准化。（C） 内源性RPA70和SENP6在RPA70（WT）或RPA70细胞株（ΔSUMO）中被敲除。转染72小时后通过胰蛋白酶法收集细胞，并用RPA70单克隆抗体进行分析。通过肌动蛋白免疫印迹对装载样品进行标准化。如图所示，SENP6敲除仅在RPA70（WT）细胞株中诱导FLAG-tagged RPA70的SUMO化，但在RPA七十（ΔSUMO）细胞系中不诱导。与对照相比，SENP6敲低细胞中RPA70的上带（ΔSUMO）略有增加。这可能是由于存在较小的SUMO化位点或实验变异。（D） RPA70（ΔSUMO）对CPT的敏感性高于野生型RPA70。在左侧面板中，携带siRNA-resistant RPA70（WT）或RPA70的HeLa细胞中内源性RPA70被敲除，如（B）所述。Rad51AP1的敲除被用作阳性对照（右侧面板）。携带siRNA-resistant RPA70（WT）或RPA70的HeLa细胞（ΔSUMO）同时转染50nM抗RPA70和Rad51AP1的siRNAs，以敲除内源性RPA70或Rad51AP1。将这些细胞进行胰蛋白酶化，并将1000个细胞接种到直径为60 mm的培养皿中。在12小时的附着期后，用增加剂量的CPT处理细胞12小时。随后用PBS清洗细胞两次，并在新鲜培养基中培养7–10天，然后固定、染色和计数菌落。图S4C显示了Rad51AP1击倒的效率。误差条表示三次分析结果的标准偏差。
图5
图5。SUMO化增强RPA70和Rad51的相互作用
（A） RPA70的SUMO化增强了其与Rad51的关联。用FLAG标记的RPA70-UBC9或FLAG标记的RPA70（ΔSUMO）-UBC9和HA标记的SUMO-2质粒共转染COS-1细胞。用FLAG-EZview™红色亲和凝胶纯化FLAG标记蛋白。用凝血酶去除C端融合的UBC9（见方法）。沉淀物用考马斯蓝（左车道）SDS-PAGE染色分离。将相同的样品进行连续稀释（1/4（1道）：1/2（2道）：1（3道）），并通过HRP-结合的抗FLAG抗体（中间道）探针进行western blot，或用于FLAG免疫沉淀首先进行SDS/PAGE，然后转移到膜上的远western blot（右面板）。将膜结合蛋白进行再变性，与重组Rad51孵育，然后用抗Rad51抗体进行检测。两个较低的波段是RPA32和RPA14。*，表示非特定带。考马斯蓝凝胶（左图）的FLAG-RPA70或FLAG-RPA 70-SUMO2区域的相对强度通过密度计测定。FLAG-RPA70设置为100%。误差条表示三次密度测量结果的标准偏差。对于中间和右侧面板，通过对不同系列稀释度的三次测量来确定平均相对强度。误差线表示三个相对强度测量的标准偏差。（B） SUMO-2与Rad51交互。将重组Rad51（500ng）与GST（500ng。10µl谷胱甘肽-Sepharose™-4B珠用于下拉实验。沉淀用抗Rad51或抗GST抗体进行免疫印迹。Ubc9此前已被证明参与SUMO-2与Rad51的绑定。然而，我们和其他人表明，在没有UBC9的情况下，SUMO-2可以直接绑定到Rad51（Ouyang等人，2009）。
图6
图6。SUMO化促进Rad51在体内外取代RPA
（A） 通过ATP酶活性的时间过程测量，SUMO化促进Rad51从ssDNA中取代RPA。右侧面板中显示了FLAG-RPA70（ΔSUMO）（圆形）或FLAG-RPA 70和FLAG-RPA-70-SUMO-2（三角形）的混合输入。用FLAG-EZview™红色亲和凝胶基质通过免疫沉淀法从COS-1细胞的裂解液中制备FLAG标记的重组蛋白，这些细胞与FLAG-RPA70-UBC9或FLAG-RPA 70（ΔSUMO）-UBC9和HA-SUMO-2 cDNA共转染，用3XFLAG肽洗脱，并用凝血酶去除C端融合-UBC9。将Rad51蛋白（2.5µM）添加到1µM FLAG-RPA70（ΔSUMO）的预成型复合物或FLAG-RPA 70和FLAG-RPA-70-SUMO-2与聚（dT）（1.5µM）的混合物中，开始反应。根据340 nm处吸光度的变化率计算ATP水解速率（见方法）。误差条表示三次分析结果的标准偏差。（B） CPT治疗后，SUMO化突变体在Rad51向RPA70病灶的募集中存在缺陷。携带siRNA-resistant RPA70（WT）或RPA70。用4µM CTP处理30min的细胞在指定时间用CSK缓冲液提取，并用兔抗Rad51和鼠抗RAP70抗体染色。只有显示5个以上明确共定位病灶的细胞核被视为阳性。在每个独立实验中，每个样本分析300多个细胞。误差条表示三次分析结果的标准偏差。（C） SUMO酸化突变导致对CPT反应的SCE事件减少。按照方法中的描述处理细胞。分析了30个中期。误差条表示一式三份分析结果的标准差。
图7
图7。RPA70氨酰化在HR调节中的作用
在正常S期，SENP6与RPA70的结合使RPA70保持在低-SUMO化状态。这用虚线表示，表示SENP6和RPA70的关联不是化学计量的。通过CPT治疗或IR暴露，SENP6与RPA70分离。然后，RPA70的SUMO化导致Rad51的招募增加，以启动HR。
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